המצאה של אלקטרודות Amperometric

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור סיבים אלקטרודות פחמן. אלקטרודות משמשות לאחר מכן כדי לזהות שחרור קטכולאמינים מתוך שלפוחית ​​עם amperometry סיבי פחמן.

Abstract

סיבים אלקטרודות פחמן הם קריטיים לצורך זיהוי של שחרור קטכולאמינים מתוך שלפוחית ​​בתאי יחיד עבור מדידות amperometry. כאן, אנו מתארים את טכניקות הדרושה כדי לייצר רעש נמוך (<0.5 רש"פ) אלקטרודות. הטכניקות שונו מן התיאורים שפורסם על ידי חוקרים קודמים (1,2). אלקטרודות מבוצעים על ידי הכנת סיבי הפחמן משחילה אותם בנפרד לתוך הצינור בכל נימי באמצעות ואקום עם מסנן כדי לשאוב את סיב. בשלב הבא, צינור נימי עם סיבים נמשך חולץ על ידי אלקטרודה, יצירת שני חצאים, כל אחד עם קצה עדין הצביע. האלקטרודות הן טבול אפוקסי, חם נוזלי מעורבב עם hardener ליצור חותם אפוקסי זכוכית. לבסוף, האלקטרודות ממוקמות בתנור כדי לרפא את אפוקסי. טיפול זהיר של אלקטרודות הוא קריטי על מנת להבטיח כי הם עשויים בעקביות וללא נזק. פרוטוקול זה מראה כיצד לפברק וחותכים אלקטרודות amperometric הקלטה של ​​תאים בודדים.

Protocol

חלק 1: Carbon Fiber הכנה

1. גזור צרור של סיבי פחמן (אנו משתמשים 7μm קוטר) באריכות כי הוא ~ 1.25 X אורך פיפטה נימי.
2. הסר את גודל על ידי הרתחה ~ 100 מ"ל של אצטון במיכל והוספת סיבים אצטון, רותחים למשך 30 דקות או יותר.
3. הסר סיבים אצטון החם, ולהעביר כוס נקייה עם 50-100 מ"ל של אצטון טרי.
4. סיבי יבש על ידי הנחת צרור על צלחת פטרי 150 מ"מ פתוח ולינה airdry.

חלק 2: Fire-ליטוש צינורות זכוכית נימי

1. Fire-פולנית כל צינור נימי (אנו משתמשים מיקרו המטוקריט צינורות נימי, 1.5mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 1.3mm, 7.5cm ארוך) על ידי החזקת הצינור במרכז עם מלקחיים וחשיפת סוף flame.Rotate את הצינור על 3 פעמים בעוד הלהבה.
2. הפוך את הצינור ואת המקום השני בסוף לתוך הלהבה, ושוב מסתובבת 3 פעמים.
3. מניחים את האש מלוטש צינורות צלחת זכוכית להעביר בתנור עד שהם מוכנים להיות מלא עם סיבי פחמן.

חלק 3: Threading סיבי פחמן לתוך צינור נימי

1. בדומה לתיאורים ידי Machado et al. (2008) ו Mundroff ו Wightman (2002), למצוץ את הסיבים לתוך צינור הזכוכית באמצעות צינורות פלסטיק מחוברים ואקום עם מסנן.
2. חותכים את הסיבים באמצעות scalpel.Leave ¼ סנטימטר החוצה סיבים של הצינור.

חלק 4: משיכת פיפטה, סיבים פולר אלקטרודה

1. המקום צינור נימי לתוך חולץ את האלקטרודה (אנו משתמשים Narishige יפן דגם PP-830) והדק את ידיות להחזיק את שפופרת נימי במקום.
2. לתפעל את מתגי לבצע שני הכוחות המושכים, להגדיר את ההגדרות חולץ אופטימלית.
3. לאחר פיפטה נמשך במחצית, להפריד בין שני החצאים על ידי חיתוך הסיב החשוף במרכז באמצעות מספריים.
4. הסר כל חצי אלקטרודה ומשוך על הסיב בולטות לשבור את הכוס seal.Trim סיבים במספריים, כך שרק 1 / 8 אינץ של סיבים נותר מחוץ של הצינור.
5. חזור על שלבים 1-4 עד בערך 16 סיבים אלקטרודות נמשכים.

חלק 5: ביצוע אפוקסי, זכוכית חותם

1. מחממים aliquot מוכנות מראש של אפוקסי על פלטה חשמלית מוגדר 55 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות במנדף קטר.
2. בעוד אפוקסי הוא חימום, לעטוף ~ 16 של אלקטרודות משך לצרור באמצעות קלטת.
3. אחרי שרף EPON מחומם למשך 6 דקות, להוסיף 0.7 גרם XOF MPDA אל שרף EPON חם (14% w / v). Mix ידי מתערבל את הבקבוקון.
4. טובלים את צרור האלקטרודות לתוך אפוקסי חם בתוספת solution.After hardener על 20 שניות, כמות מספקת של אפוקסי ייכנסו טיפים זכוכית דרך פעולה נימי.
5. ביטול, צרור אלקטרודות מקום על קרטון עם משבצות ועל המקום הזה מגש בתנור להגדיר עד 100 מעלות צלסיוס
6. לאחר 48 שעות לפחות, לבחון כל אלקטרודה תחת אלקטרודות microscope.Discard לנתח שלא להתמלא אפוקסי, יש קצה מרוסק, יש יותר סיבים, etc.After לבדוק כל אלקטרודה, ולהניח אותם בחזרה על בעל קרטון גב לתוך oven.Electrodes הם בדרך כלל טובים כחודש לאחר ייצור 1.

חלק 6: חיתוך סיבי פחמן

1. סיבי פחמן מקום האלקטרודה בזהירות על זכוכית שקופית עם סרט טפלון.
2. דמיינו את קצה תחת מיקרוסקופ לנתח.
3. השתמש להב אזמל נקי לחתוך בניצב לאורך סיבי פחמן לצאת משטח נקי שטוח עבור מיקום של סיבי פחמן נגד תא.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור חתך אלקטרודות amperometric. במהלך ההקלטות amperometric, אלקטרודה סיבי פחמן ממוקם מול פני השטח של תא הפרשה. פעילות Exocytotic הוא ציין כמו קוצים amperometric, אשר מציין הנוכחית אלקטרוכימיים הנגרמת על ידי העברת האלקטרונים לאחר חמצון catecholamines. בעזרת תרגול ביצוע חית?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C