Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

Summary

הדפסה Microcontact נעשה שימוש נרחב על חלבונים ומולקולות אחרות דפוס על משטחי חומר. אנו מדגימים את השלבים הבסיסיים של תהליך זה, ביול דפוסים של פיברונקטין על זכוכית.

Abstract

היכולת חלבונים דפוס ביומולקולות אחרים על גבי מצעים חשוב לתפוס את המורכבות של הסביבה המרחבית תאיים. פיתוח והדפסה microcontact ידי קבוצת Whitesides (

Protocol

1. ההכנה של פתרונות וחומרים

פעולות אלה צריכות להתבצע מספר ימים מראש.

1. זכוכית coverslips. Coverslips נוקו על ידי טבילה למשך 10 דקות לתוך תמיסה של חומר ניקוי 7x Linbro: מים, מעורבות בבית 1: 3 יחס ומחוממת, עם ערבוב, עד ברור. Coverslips היו שטופים נרחב עם מים deionized, אפויים אז במשך 6 שעות על 450 מעלות צלזיוס. טוען coverslips לתוך מתלים מכתים קרמיקה (ראה ריאגנטים) פשוט התהליך הזה.
2. חלבון פתרון ביול. מחדש פיברונקטין ההנחיות ליצרנים פתרון המניות של ריכוז מ"ג / מ"ל ​​1.

2. מבצע בולים מן האדון טופולוגי

צעדים אלה יכולים להתבצע מספר ימים מראש. חנות בולים דפוס-up בצלחת מכוסה, כגון צלחת בתרבית רקמה.

1. הסרת אבק משוחרר מן האדון באמצעות זרם של דחוס, אוויר מסונן או גז אינרטי.
2. המקום, מאסטר בצד בדוגמת למעלה, בחלק התחתון של צלחת פלסטיק פשוט גדול יותר לשלוט. 60 - או 100 מ"מ תרבות מנות רקמה מתאימים היטב למטרה זו.
3. בתוך צינור 50 מ"ל פוליסטירן צנטריפוגות, לשלב את רכיבי Sylgard ביחס של סוכן ריפוי: בסיס אלסטומר של 1: 10 לפי משקל. מערבבים היטב בעזרת מכשיר פלסטיק, כגון טפטפת הפנויה. הכן לפחות 0.2 מ"ל של אלסטומר לסנטימטר מרובע של שטח צלחת.
4. צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב G 300 דקות 5 להסיר בועות אוויר.
5. יוצקים את אלסטומר על המאסטר, אז מקום ייבוש, תחת ואקום, במשך 30 דקות.
6. Cure אלסטומר בתנור על 65 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. אשפרה בטמפרטורות גבוהות ועל פי התוצאות כבר אלסטומר נוקשה. בואו להתקרר לטמפרטורת החדר.
7. הפרד את גיליון הבולים מן האדון.

3. Microcontact הדפסה של פיברונקטין על זכוכית

1. לגזור חותמת אחת. בולים מדידה 4 מ"מ x 4 מ"מ עד 1 ס"מ X 1 ס"מ באזור ו 1-2 מ"מ עובי הם הקלה ביותר להתחיל עם. מניחים בצד עד דפוס בשקופית זכוכית או צלחת פלסטיק קטנה.
2. המקום בול שואב פלזמה, תהליך, תחת ואקום, למשך 30 שניות. מדעי Harrick מנקה פלזמה (ראה ציוד), נקבע על הגדרת הגבוהה ביותר הפלט יציג את פני השטח PDMS הידרופילי. כבר פעמים לגרום פיצוח של אלסטומר.
3. לדלל את הפתרון פיברונקטין עם מים deionized לריכוז הטבעה של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
4. המקום טיפה קטנה (10-50 μl) של הטבעה פתרון הבול. זה יתפשט על פני השטח הידרופילי. הוסף רק פתרון מספיק כי ירידה מכסה את החותמת, אבל לא לדרוס את הקצוות. בואו לספוג חלבון חותמת במשך 5 דקות.
5. באמצעות ® Kimwipe או נייר אחר רקמות נקייה, הפתיל את רוב הפתרון חלבון מן הבול, בלי לגעת באזור בדוגמת.
6. יבש הפתרון שנותר חותמת תחת זרם של גז נקי, יבש, אדיש, ​​כגון חנקן.
7. בעזרת פינצטה, להסיר את חותמת משקופית הזכוכית, להפוך, ומקום במגע עם coverslip הזכוכית לנקות (את פני השטח להיות בדוגמת). מניחים משקל על גבי לקדם קשר טוב. משקל סגולי המספק את דפוסים הטובה ביותר תלויה בגודל בול דפוס; להתחיל עם משקל 5 גרם, ולהתאים בין stampings. השאירו חותם על קשר עם השטח עבור 1 דקות.
8. בזהירות לפרק את הערימה, חותמת נפרדת coverslip.
9. בתוקף לשטוף את coverslip בדוגמת ב-PBS, ואחריו מים deionized, להסיר חלבון שאינו adsorbed אל פני השטח. Coverslip יבש תחת זרם חנקן.

נציג תוצאות

הדפסה Microcontact הוא תהליך רב עוצמה עבור דפוסים מולקולות על משטחים. תהליך זה יש את היכולת ליצור תכונות עם ממדים החל עשרות מיקרומטר עד מאות ננומטרים; באיור. 1A, את הלוגו בצד שמאל נמצאים כל 200 מיקרומטר גובה, בעוד כתמים ירוקים מאויר באיור. 1B הם 1 מיקרומטר בקוטר במרווחים של 4 במרווחים מיקרומטר, נמדד מרכז אל מרכז. איור. 1B גם ממחיש מאפיין עוצמה של הדפסה microcontact, כלומר שזה תהליך כתוסף. מספר סיבובים של הדפסה microcontact יכול להיות מיושם על פני אחד כדי ליצור multicomponent מערכות ^3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תהליך ההדפסה microcontact היא פשוטה מבחינה מושגית חזקים מאוד, לאחר הוחל על דפוסים מגוון רחב של מולקולות על מגוון מצעים. עם זאת, תהליך זה נשאר משהו של האמנות. הגיאומטריה מסוים של דפוס להיווצר, חלבון להיות בדוגמת, משקל מוחל, ציפוי / הטבעה כל התנאים להשפיע על איכות הטבעה. לדוגמה, גם משקל קטן...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma Cleaner		Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G
Desiccator		Nalge Nunc international	5315-0150
PBS	Reagent	Invitrogen	10010-072
Protein labeling kit	Reagent	Invitrogen	A30006
Fibronectin	Reagent	Sigma-Aldrich	F2006
Staining rack	Reagent	Thomas Scientific	8542E40
Coverslips	Reagent	Fisher Scientific	12-544-12
Sylgard 184	Reagent	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
Diffraction Grating	Reagent	Edmund Scientific	3040267