Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Summary

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.

Abstract

ליגנד-מגודרת תעלות יונים ביסוד תקשורת הסינפטי במערכת העצבים ^1. אצל יונקים יש שלוש משפחות של ליגנד-מגודרת ערוצים: את הלולאה cys, גלוטמט ו-מגודרת ערוצי קולטן P2X ^2. בכל מקרה המחייב של המשדר המוביל פתיחת הנקבוביות שדרכו יונים לזרום למטה הדרגתיים אלקטרוכימיים שלהם. רבים ליגנד-מגודרת הערוצים גם חדיר יוני סידן ^{3, 4,} אשר במורד איתות תפקידים ⁵ (תקנה למשל גן) כי תעלה את משך הזמן של פתיחת הערוץ. לפיכך ליגנד-מגודרת ערוצי יכולה לאותת על סולמות זמן רחב החל כמה אלפיות כדי ימים. בהינתן אלה תפקידים חשובים יש צורך להבין כיצד ליגנד-מגודרת תעלות יונים עצמם מוסדרים על ידי חלבונים, ואיך החלבונים האלה עשויים לכוון איתות. מחקרים אחרונים מצביעים על כך רבות, אם לא כולם, ערוצי עשוי להיות חלק קומפלקסים חלבונים איתות ^6. במאמר זה נסביר כיצד לזהות את החלבונים אשר נקלטות על ידי ה-C-מסוף ההיבטים של תחום P2X2 הקולטן cytosolic.

קולטנים P2X הם ATP-מגודרת ערוצי קטיון וכוללת שבע יחידות משנה (P2X1-P2X7). קולטנים P2X באים לידי ביטוי נרחב במוח, שם הם לתווך שידור סינפטיים מעוררים ועל סיוע presynaptic של שחרור הנוירוטרנסמיטר ^7. קולטנים P2X נמצאים תאים להתרגש ולא להתרגש לתווך תפקידי מפתח איתות דלקת עצבית, ותפקוד הלב וכלי הדם ^8. P2X2 קולטנים נפוצים במערכת העצבים ⁹ הם המוקד של המחקר הזה. למקטע כל P2X נחשב בעל שני חלקים קרום פורש (TM1 & TM2) מופרדים על ידי אזור תאי ⁷ ו-N ו-C תאיים טרמיני (איור 1a) ^7. יחידות משנה P2X ¹⁰ (P2X1-P2X7) מראים הומולוגיה ברצף 30-50% ברמת חומצת אמינו ^11. קולטנים P2X מכילים רק שלוש יחידות משנה, המהווה את stoichiometry הפשוטה בין קולטנים ionotropic. P2X2 C-הסופית כוללת של 120 חומצות אמינו (איור 1b) והוא מכיל כמה חלבון העגינה אתרים קונצנזוס, התומכים בהשערה כי P2X2 קולטן עשוי להיות חלק מתחמי איתות. עם זאת, למרות מספר פונקציות יוחסו הסופית-C של P2X2 קולטנים ⁹ המחקר לא תיאר את השותפים מולקולרית כי בני הזוג לצד תאיים של חלבון זה דרך באורך מלא C-הסופית. במאמר זה אנו מתארים שיטות גישה proteomic לזהות את החלבונים אינטראקציה עם באורך מלא C-הסופית של P2X2 קולטנים.

Protocol

ניסיונית נהלים

הליך הניסוי (איור 2) מורכבת מארבעה חלקים המתוארים בצורה צעד חכם למטה.

חלק 1: Subcloning וביטוי של התחנה-C של P2X2 קולטנים.

אנחנו הבענו את אורך מלא C-הסופית של P2X2 קולטנים חיידקים כדי לזהות את החלבונים במוח שאליו הוא נקשר.

1. C-הסופית (שאריות 353-472) של הקולטן P2X2 (איור 1) היה מוגבר על ידי ה-PCR, משובטים לתוך pGEX 4NT1 (GE מדעי החיים) ומאומת עם רצף.
2. פלסמיד רקומביננטי הפך E. קולי (BL21) לביטוי של חלבונים רקומביננטי.
3. מניות גליצרול של חיידקים (E. coli BL21) המכיל את P2X2 CT-GST פלסמיד נגררו עם קצה פיפטה סטרילית מחוסן לתוך 5 מ"ל של לוריא-Bertani (LB) בתקשורת עם סמן סלקטיבי מתאים (50 גרם / מ"ל אמפיצילין) ו מודגרות לילה ב 37C ב שייקר מסלולית.
4. תרבויות גדל בן לילה היו מחוסן לתוך 250 מ"ל של LB עם התקשורת אנטיביוטי מתאים (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין) ו מודגרות ב שייקר מסלולית בסל"ד 250 עבור 2-3 שעות ב 37C עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר הגיע ~ 0.6-0.7.
5. התרבות היה מושרה עם 1 מ"מ של IPTG ו מודגרות נוספת 3 שעות עבור ביטוי החלבון על 37C.
6. התרבות היה אז הסתובב במשך 15 דקות ב 4C (1ml של התרבות ניצל לניתוח רמת הביטוי תויגה כ 'המושרה') בשעה 5000 גרם. Supernatant היה מושלך לבין גלולה היה resuspended ב 20 מ"ל של תמיסת מלח טריס-EDTA (STE) חוצץ (10 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0).
7. ההשעיה היה סובב על 5000 גרם במשך 15 דקות בתוך שפופרת 50 מ"ל בז. Supernatant היה מושלך ואת חצי יבש גלולה הוקפא ב-70C לילה.
8. -70C גלולה היה resuspended ב 40 מ"ל של חיץ קרים תמוגה (2% (w / v) sarkosyl, 15 מ"ג ליזוזים, 150 mM NaCl, 50 מ"מ טריס pH7.5, 5 DTT מ"מ הלוח המלא מעכבי פרוטאז) ו ההשעיה הודגר על קרח למשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה, 3 מ"ל גלוטתיון-Sepharose חרוזים 4B נשטפו עם 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS) ו - 20 מ"ל T-PBS (0.1% (V / V) tritonX-100 ב PBS) ואחריו PBS. החרוזים היו resuspended ב 1 מ"ל PBS.
9. השעיית חיידקי היה להקפיא מופשר 3 פעמים בחנקן נוזלי sonicated (1s on / off, 30 מיקרון עבור 3 דקות על הקרח) ו מודגרות נוספת למשך 30 דקות עם 4% (v / v) טריטון X-100, 10 mM MgSO ₄ ו 2 mM ATP על קרח.
10. Lysate היה סובב על 20,000 גרם במשך 15 דקות ב 4C ו גלולה היה מושלך (מדגם גלולה ו 1 מ"ל של supernatant ניצל דף SDS כדי לבדוק את כמויות של חלבונים cytosol ממברנות). Supernatant הודגר עם חרוזים עבור שעות 1 (או לילה) בשעה 4C.
11. החרוזים היו סובב ב 500 גרם דקות 5 ו supernatant היה מושלך (מדגם ניצל לשבריר מאוגד). החרוזים נשטפו עם T-PBS חמש פעמים (שוטף ניצלו עבור פקדי לשטוף).
12. החרוזים היו resuspended אז PBS לתת 50% (w / v) slurry ואוחסנו במקרר בבית 4C עד לשימוש. ריכוז החלבון הוערך על ידי ברדפורד assay (לפי הוראות היצרן).

חלק 2: הכנת lysates המוח כולו

P2X2 רצפטורים ידועים לידי ביטוי בשפע במוח ^8. במהלך ניתוחים הנוכחי, ביקשנו לזהות את החלבונים אינטראקציה עם רצפטורים P2X2 מ שלם חולדה lysates המוח (איור 3).

1. מוח החולדה למבוגרים היה לקצור (בעלי חיים הוקרבו על פי פרוטוקול UCLA IAACUC באישור ועל פי מדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה) ושטף מיד קרים PBS (3X).
2. כדי lyse התאים 10 מ"ל (~ 5 פעמים את משקל רטוב של המוח שנקטפו) של חיץ קרים תמוגה המכיל 150 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NAF, 1 mM Na ₃ VO _4, 1 mM PMSF, 5 מיקרוגרם / מ"ל של leupeptin, 1% (v / v) NP-40, וכן מעכבי פרוטאז לוח קוקטייל נוסף במוח שנקטפו.
3. רקמת המוח היה homogenised על הקרח עם homogenizer Dounce זכוכית עד תערובת הומוגנית של עקביות הושגה.
4. Lysate Cell היה סובב על 2000 גרם במשך 5 דקות כדי להסיר את התאים רצוף. Supernatant נאסף וסובב שוב למשך 60 דקות בכל גרם 29000 להסיר אברונים שלמים אגרגטים הממברנה.
5. מיד לאחר צנטריפוגה supernatant הועבר צינור נקי. ריכוז החלבון של lysate המוח כולו נמדד על ידי assay ברדפורד (בדרך כלל ~ 15 מ"ג / מ"ל).
6. Lysate היה aliquoted ומאוחסנים ב-70C.

חלק 3: בידוד של P2X2 C-זנב הקשורים חלבונים

כדי לזהות את השותפים מחייב P2X2 CT-GST מ lysates המוח כולו, למשוך למטה assay בוצעה באמצעות CT-GST משותקת על גלוטתיון חרוזים sepharose 4B כפיתיון. עבור פקדים, GST לבד חייב חרוזים היה בשימוש.

1. המוח lysate היה precleared עם חרוזים GST עבור שעה 1 ב 4C. גלולה היה מושלך ואת supernatant שימש מנתח נוסף.
2. כמויות שוות של GST ו P2X2 CT-GST (10 מיקרוגרם) חייב גלוטתיון sepharose 4 חרוזים B הודגרו לילה עם 100 גרם של חלבונים solubilised precleared מ lysate המוח כולו חולדה, עם סיבוב ב 4C במאגר תמוגה.
3. חרוזים היו הסתובב בבית ג'1000 דקות 5 ו supernatant נמחקה.
4. החרוזים נשטפו פעם עם למאגר תמוגה ו מבושל שונה Laemli חיץ [4% (w / v) SDS, 10% (V / V) 2 mercaptoethanol, 2% (v / v) גליצרול, 0.004% (w / v) bromophenol כחול 0.125 M TrisCl pH 6.8] במשך 5 דקות.
5. הדגימות סובב ב 5000 גרם דקות 5 ו supernatant מופרדות 10% SDS-PAGE (איור 4). ג'ל הוכתמו ג'ל רובי חלבון SYPRO כתם (לפי הוראות היצרן) ו דמיינו באור אולטרה סגול. P2X2 CT הקשורים חלבונים הושוו לאלו החלים באמצעות GST-null כפיתיון. ארבעה ביולוגיים משכפל בוצעו (כלומר four מוח וארבעה ומורדות למשוך עצמאי).

חלק 4: זיהוי של חלבונים.

חלבונים מופרדים על ידי ג'ל אלקטרופורזה היו נכרת מן הג'ל וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה ^12. הערה: העדר אבק לאורך כל התהליך הוא קריטי כדי להפחית את זיהום קרטין. הנסיין צריך ללבוש מסיכה, נטו שיער כפפות כל הזמן ואף פעם לא לגעת באזור ג'ל הריבית ללא שימוש בכפפות.

1. להקות כל חלבון גלוי התאושש למשוך P2X2 למטה היו נכרת בסכין גילוח נקי חתוך לקוביות (איור 4). אזורים מקבילים של הג'ל ב GST-null למשוך במורד השביל היו נכרת גם מבלי להתייחס מכתים הלהקה (להקות ספציפיות הפיתיון GST-null היו נכרת גם מזוהה) על מנת להבטיח כי נוכחות של חלבונים מתחת לרמה של באותו אופן רגישות מכתים לא לפספס.
2. חתיכות ג'ל הודגרו עם 200 μl של אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ 50% (v / v) אצטוניטריל (ACN) ואת צינורות vortexed במשך 15 דקות ב RT. חזור על שלב זה לשטוף.
3. חתיכות ג'ל היו מיובש על ידי הוספת 200 אצטוניטריל μl (חתיכות ג'ל צריך להתכווץ ולהפוך אטום בצבע).
4. Acetontrile הוסר החלקים ג'ל מיובשים speedvac למשך 10 דקות ~.
5. חתיכות ג'ל הודגרו אז עם 30 μl של המוכן טרי DTT/10 10 מ"מ טריס (2-carboxy-אתיל) hydrochloride phosphine (TCEP) של נפח מספיק לטבול את השברים. זה היה שמאל למשך 30 דקות בכל אמבט מים 56C.
6. הפתרון הבא DTT הוחלף 100 μl ביקרבונט 500 mM אמוניום בתמיסה אצטוניטריל 50% ואת פרוסות ג'ל רחצה עם ביקרבונט ammounium.
7. הפתרון הכביסה aspirated ו 200 μl של אצטוניטריל הוסיף מייבשים את הג'לים.
8. אצטוניטריל הוסרה אז 100 μl הכין טרי 100 iodoacetamide פתרון mM נוספה alkylate sulfhydryls חינם. צעד זה המשיך במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
9. פתרון Iodoacetamide הוסר החלקים ג'ל נשטפו עם 200 μl של אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ ב acetontrile 50% (pH 8.0) עבור 2 דקות תוך vortexing. צעד זה לשטוף חזר על עצמו.
10. לאחר הסרת פתרון לרחוץ, חתיכות ג'ל הודגרו עם אצטוניטריל 200 μl אשר הוסר לאחר מכן על ידי ~ 10min speedvac.
11. בשלב זה את החתיכות בג'ל מוכנים העיכול טריפסין. חתיכות ג'ל הודגרו בתמיסה 30 טריפסין μl (20 ng / μL ריכוז עובדים) והניח על קרח למשך 10 דקות עבור ג'לים להיות נפוחים היטב. טריפסין עודף הוסר rehydrated חלקיקי ג'ל ועליהן μl 30 עם אמוניום ביקרבונט 50 mM כדי למנוע מהם שקוע לאורך מערכת העיכול אשר הורשה להמשיך במשך 12 עד 16 שעות ב 37C.
12. חמש μl של 5% (v / v) חומצה פורמית מתווסף לבטל את העיכול טריפסין ולעצור.
13. צינורות היו vortexed במשך 15 דקות ו ~ centrifuged בקצרה להביא את הנוזל אל החלק התחתון של הצינור, אשר הועברה לאחר מכן בקבוקון 0.5 נקי שכותרתו מ"ל.
14. הבא 30 μl של 0.1% (v / v) חומצה פורמית ב אצטוניטריל 50% נוספה חתיכות ג'ל אז הם היו רק מכוסה ואחריו vortexing פעמיים 10-15 דקות, מופרדים על ידי צנטריפוגה קצר. צעד זה חזר על עצמו פעם אחת, החלפת חומצה פורמית, אצטוניטריל בין השלבים.
15. הנוזל הסופי הוסר כל פתרון מיצוי בשילוב בקבוקון אחד. נפח זה הופחת ל UL 30 ~ ב speedvac. המדגם היה מוכן כעת כרומטוגרפיה הפוכה שלב ננו נוזלים זיהוי החלבון על ידי ספקטרומטריית מסה. בדוגמה זו ספציפית, שלב זה מתבצע על ספקטרומטר טנדם Orbi-מלכודת המונית ThermoFisher (שנבחר דיוק המסה הגבוהה שלו, מחזור מהיר לגילוי חלבון ותכונות הפעלה יציבה בדרך כלל), למרות דגמים אחרים ומכשירים היצרנים יכול בקלות להיות בשילוב עם הגישה המתוארת לנקודה זו.
16. הפרטים ואת הקריטריונים מנתח spectrometric מסה כעת הציג בקצרה. פפטידים כל הופרדו על ידי שלב הפוכה ננו LC (Eksigent) ופפטידים הועמסו על עמודה הפוכה שלב C18 בקצב הזרימה של μl 3 / min. Mobile שלב היה חומצה פורמית 0.1% ו ACN 2% מים; שלב ב 'הנייד היה חומצה פורמית 0.1% ו 20% מים ב ACN. פפטידים היו eluted מהעמודה בקצב הזרימה של 220 nl / min באמצעות שיפוע ליניארית מ-B ל-B 5% -50% על פני 90 דקות, לאחר מכן ב 95% מעל 5 דקות, ולבסוף שמירה ב 95% קבוע 5 דקות . ספקטרה נרכשו במצב נתונים תלויי עם מלכודת-Orbi המשמש סריקות MS ו LTQ עבור MS / MS סריקות. פפטידים זוהו על ידי חיפוש ספקטרום מול מסד הנתונים של עכברוש IPI v.3.53 באמצעות אלגוריתם SEQUEST משולבים בחבילת התוכנה Bioworks. פפטיד כל נפגשו הקריטריונים הבאים: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2) ≥ 4 (3), ו DeltaCN> 0.1. ספקטרה כל המשמשת לזיהוי חלבונים נבדקו באופן ידני וחלבונים לא מקובל כאשר פחות משני פפטידים זוהו. חלבונים רק בהווה הבאים בכל אחד מארבעת P2X2 ומורדות למשוך נעדר במהלך GST-null ומורדות למשוך נחשבו עבור ניתוחים נוספים.

באיור 1. ייצוג סכמטי של למקטע P2X2 קולטן. א הקריקטורה ממחישה את הטופולוגיה של למקטע P2X2 קולטן. תחום cytosolic מורכב N ו-C טרמיני. C-הסופית של הקולטן P2X2 (אדום) ששימשה כפיתיון למשוך את assay. רצף חומצות אמינו ב 'של הקולטן P2X2 C-הסופית השתמשו במחקר זה.

איור 2. תרשים זרימה קו הזמן של פרוטוקול המשמש ביטוי, טיהור, לנתץ וזיהוי של חלבונים. אנחנו מראים את קווי המתאר של הפרוטוקול עם קו הזמן. עכברוש למבוגרים lysate המוח היה מוכן טרי מיד לפני השימוש על מבחני למשוך למטה.

איור 3. ייצוג סכמטי של ניתוח proteomic בינארי של רשת C-הסופית P2X2 במוח חולדה. C-הסופית של P2X2 קולטנים התמזגו עם חלבון GST חייב חרוזים GST שימש לנתץ מבחני. המוח lysate הוכן וחלבונים הודגרו עם חלבונים רקומביננטי משותקת. חלק מאוגד נשטף למאגר תמוגה. החלבונים שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה.

איור 4. זיהוי שותפים מחייב הסופית-C של P2X2 קולטנים. ג'ל Sypro מוכתם מראה מגוון של חלבונים המשוערת כי אינטראקציה עם הסופית-C של קולטנים התמזגו עם GST (הקופסה הכחולה). בקרת נתיבים עבור GST לבד (תיבת צהוב) ו - גלוטתיון חרוזים sepharose לבד מוצגים גם. החצים מצביעים על דוגמאות של להקות ייחודי שהיו נכרת לצורך ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תעלות יונים הם קבוצה גדולה של חלבונים בממברנה נפרד. הם מכילים מים מלא נקבוביות כי סלקטיבי לאפשר תנועה של יונים מטה הדרגתיים אלקטרוכימי על פני קרום התא. יון ערוצי השער פתוח בין המדינות סגור. צעד gating מופעלת על ידי משדרי (למשל ATP) במקרה של P2X ערוצי ליגנד מגודרת יון, או שהוא ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Reagent	JT Baker	9829-02
Acrylamide	Reagent	Bio-Rad	161-0156
Ampicillin	Reagent	VWR international	VW1507-01
Ammonium Bicarbonate	Reagent	Fluka	09830
Ammonium Persulphate (APS)	Reagent	Sigma-Aldrich	A3678
Adenosine Triphosphate (ATP)	Reagent	Sigma-Aldrich	A7699
Bradford reagent	Reagent	Bio-Rad	500-0006
Bromophenol blue	Reagent	Fisher Scientific	B-392
Commassie blue R-250	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-24972
Dithiotritol (DTT)	Reagent	EMD Millipore	3860
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Reagent	VWR international	VW1474-01
Ethylene Glycol tetraacetic acid (EGTA)	Reagent	Sigma-Aldrich	E8145
Formic acid	Reagent	EMD Millipore	11670-1
Glutathione Sepharose 4B beads	Reagent	GE Healthcare	17-5132-01
Hydrochloric acid (HCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	H1758
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagent	Sigma-Aldrich	15502
Iodoacetamide	Reagent	Sigma-Aldrich	I1149
Luria-Bertani (LB) Media	Reagent	EMD Millipore	1.00547.5007
Leupeptin	Reagent	Sigma-Aldrich	L8511
Lysozyme	Reagent	Sigma-Aldrich	62971
Magnesium Sulphate (MgSO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Chloride (NaCl)	Reagent	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Flouride (NaF)	Reagent	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Reagent	Sigma-Aldrich	S6508
Nonidet P40	Reagent	Fluka	74385
Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF)	Reagent	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Reagent	Sigma-Aldrich	S8820
Protein standard	Reagent	Bio-Rad	161-0305
Sarkosyl	Reagent	Acros Organics	61207
Screw top vial	Tool	Agilent Technologies	5182-0866
Sodium dodecyl sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	L4509
SYPRO® Ruby protein gel stain	Reagent	Bio-Rad	170-3125
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Reagent	Sigma-Aldrich	T9281
Tris base	Reagent	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T9284
Trypsin	Reagent	Promega Corp.	V5111
Tween 20	Reagent	Sigma-Aldrich	P5927
Water	Reagent	Burdick & Jackson	365-4
LTQ-Orbitrap tandem mass spectrometer	Tool	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Nano Liquid Chromatography System	Tool	Eksigent
B-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol		EMD Millipore	GX0185-6