דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Summary

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

Abstract

שלמה הר

Protocol

1. קיבעון

1. תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS.
2. הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
3. עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים שען. לאחר dechorionation, העוברים מועברים באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר כיוון שהם עלולים לדבוק pipettes פוליפרופילן.
4. העברת עוברים דרך סדרה של 25%, 50% מתנול 75% PBS במשך 5 דקות כל אחד.
5. החלפת נוזל עם 100% מתנול, דגירה 5 דקות ולאחר מכן להחליף עם מתנול טריים.
6. מקום בו עוברים -20 ° C למשך תקופה מינימלית של שעה אחת. (אנחנו בדרך כלל לדגור העוברים בין לילה. רגיל ב הכלאה באתרו יעבוד על עוברי מאוחסן במשך יותר משנה, אבל אנחנו לא בחנו אם ברזולוציה גבוהה של ניאון הכלאה באתרו הוא איבד ידי אחסון ממושך.)
7. לשטוף עוברים במשך 5 דקות כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBST ב RT. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.
8. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
9. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBST ב RT.

הערה לגבי PFA:
אנו מאחסנים PFA 4% aliquots ב -20 º C (ראה טבלה של ריאגנטים). עבור קיבעון הראשוני, אנחנו רק להשתמש PFA שלא הופשר קודם לכן. עבור הקיבועים הבאים, אנו מרבים להשתמש PFA כי הופשר קודם לכן. קיבוע ראשוני נראה קריטי עבור מכתים מוצלחת עם פרוטוקול זה.

2. Proteinase AND POSTFIXATION

1. תקציר עם proteinase K (5μg/ml ב PBST) בשעה RT במשך 3 עד 12 דקות כדי permeabilize את העוברים. (זמן הדגירה תלוי בגילו של עוברים כמו שלבים צעירים רגישים יותר. זה גם תלוי אצווה של האנזים.) לקבלת עוברים שלב somitogenesis, אנחנו בדרך כלל permeabilize במשך 3-4 דקות. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
2. לשטוף בקצרה PBST ולשטוף פעם במשך 5 דקות בתוך PBST.
3. תקן שוב למשך 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
4. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

3. PREHYBRIDIZATION

1. דגירה עוברים במשך 5 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב-HYB.
2. Prehybridize ב-C º 65 במשך שעה לפחות 1 ב HYB +.

4. הכלאה

1. הסר את כל אבל 50 μl של preHYB, אך הקפד לשמור את העוברים שקוע לחלוטין.
2. הוספת 1-2 μl של כל riboprobe (digoxygenin ו והעמסת שכותרתו riboprobes) על ידי עוברי ומערבבים בעדינות מצליף את הצינורית. כמות בדיקה הוא בדרך כלל 1-2μl מ תגובה בדיקה 20μl סינתזה.
3. בהתחשב בכך והעמסת הוא רגיש לאור, צינורות יש לעטוף בנייר אלומיניום או אחרת חשוף לאור מינימלי מרגע זה והלאה.
4. דגירה עוברים לילה בשעה 65 º C.

5. בדיקה הסרת

ראוי לציין, כי הפתרונות של חומר ניקוי זה חוסר קדימה נקודה. ביעור של חומר ניקוי מופיעה לעזור התגובות מכתים אך גורם העוברים להיות דביק למדי.

1. הסר את riboprobe.
2. לשטוף 2 x 30 דקות ב-C º 65 ב formamide/2xSSC 50%.
3. שטפו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות ב 2 x SSC.
4. שטפו במשך 30 דקות 65 מעלות צלזיוס ב 0.2 x SSC.

6. אנטי נוגדנים והעמסת הדגירה

1. חסום במשך שעה לפחות 1 ב RT ב 500μl של פתרון של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם (ראה טבלה של ריאגנטים).
2. הוסף את הנוגדן אנטי והעמסת-POD, כפי שסופק על ידי חברת רוש, בדילול 1:500 בפתרון חסימה.
3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

7. זיהוי של בדיקה והעמסת-מדביקים לו תווית של

1. דגירה 30-60 דקות פתרון ה-TSA והעמסת פלוס. (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר פרקין אלמר diluent הגברה.) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה. למרבה הצער, התגובה מכתים לא ניתן לנטר חזותית כמו המצע הוא פלורסנט, ואחד יראה פלואורסצנטי ירוק בכל מקום ברחבי התגובה מכתים.
2. שטפו במשך 10 דקות כל אחד 30%, 50%, 75% ו 100% מתנול ב PBS.
3. דגירה בתמיסה של 1% H ₂ 0 ₂ מתנול במשך 30 דקות כדי להשבית peroxidase הראשון.
4. שטפי 10 דקות כל אחד 75%, 50% ו - 30% מתנול PBS. לאחר מכן לשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל אחד PBS. חשוב שכל נפגשוhanol להסירו.

הערות על הגברה האות TYRAMIDE:
We have been באמצעות פרקין אלמר ערכות ה-TSA. אנו מוצאים כי Alexa-Tyramide מצעים כתם גם באמצעות פרקין אלמר diluent חיץ הגברה, אבל אנחנו לא נחלו הצלחה באמצעות חיץ מכתים מסופק עם ערכות בדיקות Invitrogen / מולקולרית. לבסוף, מצאנו כי Cy5 הקרינה מסולק על ידי טיפול שלאחר מכן מתנול / H ₂ O ₂ ואילו והעמסת Alexa ו-647 אינם מושפעים. Cy3 עשוי גם להיות מושפע לרעה את הטיפול מתנול / H ₂ O ₂ כפי שהוא קשור מבנית Cy5. מסיבה זו, Cy3 ו Cy5 תגובות TSA יש להשתמש רק עבור התגובה מכתים השני ניאון כפול פרוטוקול באתרה.

8. אנטי Digoxygenin נוגדן הדגירה

1. חסום את העוברים שוב במשך שעה לפחות 1 ב RT בתמיסה של חיץ 1x חומצה maleic בתוספת 2% ריאגנט חוסם.
2. הוסף את הנוגדן אנטי DIG POD כפי שסופק על ידי רוש בדילול 1:1000 ב לעיל חסימת פתרון
3. דגירה לילה ב 4 º C. במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו.
4. שטפי 4 x 20 דקות חיץ 1x חומצה maleic. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל אחד PBS.

9. זיהוי של בדיקה Digoxygenin-מדביקים לו תווית של

1. דגירה 30-60 דקות TSA פלוס Cy5 פתרון (ספין למטה המצע TSA לפני קבלת פתרון מכתים. עבור התגובה, לדלל מגיב tyramide 1:50 במאגר diluent הגברה) במהלך הדגירה זה, אנו להניח את שפופרת microcentrifuge על צדו. זמן התגובה צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל בדיקה.
2. לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBST.

10. PROPIDIUM מכתים יודיד

1. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל 2 x SSC.
2. דגירה עוברים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 50 μl 2 x SSCT עם 10 RNAse μl (ריכוז סופי של 100μg/ml).
3. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
4. הכתם עוברים במשך 8 דקות בתמיסה של יודיד propidium 330μg/ml ב 2 x SSC.
5. לשטוף שש פעמים במשך 3 דקות כל אחד 2 x SSC ב RT.
6. תקן 20 דקות ב PFA 4% PBS ב RT.
7. לשטוף פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד, PBST ב RT.

11. הרכבה

1. דגירה עוברים במשך 10 דקות כל אחד 25% גליצרול ו 50% PBST. נקה לילה גליצרול 75% ב 4 º C.
2. אנחנו מחלקים את העוברים ואת deyolk ושטוח הר אותם בשקופית מיקרוסקופ. החלמון יכול לייצר הקרינה רקע משמעותי. Dissection הרבה יותר קל אחרי העוברים ניקית ovenight ב gylcerol.

פתרונות:

PBST	PBS פלוס 0.1% Tween
SSCT	SSC פלוס 0.1% Tween
HYB-	50% לפוראמיד 5xSSC 0.1% Tween-20
HYB +	HYB- 5mg/ml torula (שמרים) RNA 50μg/ml הפרין	RNA torula מוכן ידי עיכול K proteinase של רנ"א עם פנול, לאחר מכן, פנול, כלורופורם, ו כלורופורם extraction.The-RNA הוא זירז ו מומס במים DEPC שטופלו.
1 x חיץ חומצה maleic	150mm חומצה maleic, NaCl 100mm (pH 7.5)

באיור 1. תוצאות נציג הר שלם פלורסנט כפול הכלאה באתרה. (AC). תמונות להראות קטע confocal יחיד דרך האזור האחורי של עובר דג הזברה בשלב עשר somite. הנוף הגב עם הקדמי למעלה. מוכתם גרעינים עם יודיד propidium הם בצבע כחול. (א) mRNA deltaC זוהה באמצעות riboprobe digoxygenin שכותרתו ו-TSA Cy5 מגיב. (ב) mRNA עיבד מן הגן her1 זוהה עם riboprobe והעמסת שכותרתו ו-TSA והעמסת מגיב. (ג) תעלות מיזוג ירוק ואדום באופן חד משמעי מזהה אזורים של ביטוי גנים שונים או חופפים של שני גנים. (D, E) פירוט הביטוי her1 הוכחת ברזולוציה גבוהה של הליך זה. לוקליזציה subcellular של mRNA ניתן להבחין בבירור. ראשי חץ להצביע על תא מציג שעתוק פעיל, חשף ידי נקודות של מכתים בגרעין. החצים מצביעים על התא המציג לוקליזציה cytoplasmic של mRNA. (F, G) מכתים פעמיים עבור her1 ו deltaC מגלה התאים לתעתוק שני גנים (חץ לבן), או גן או בנפרד (ראשי חץ אדום וירוק).

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade	Roche Group	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent	Roche Group	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche Group	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments	Roche Group	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free	Roche Group	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.