הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Summary

בסרט זה אנו מציגים את לשעבר vivo דור והרחבת CD40 המופעל בתאים אנושיים B (CD40-B) מתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) על ידי גירוי עם ליגנד CD40 ו - interleukin-4.

Abstract

CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן ^1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) ^3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (> 10 ⁹ תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) ^1,4.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) ^5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2).

לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של ^{1 לתפקד, 4.} תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T ^6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T ^7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים ^9.

Protocol

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים אנושיים B מ PBMC מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד להביע NIH/3T3 תאים, אשר ישמש צלחת הנכנס לתאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל CD40-B.

א הכנת תאים מזין (tCD40L NIH/3T3)

NIH/3T3 tCD40L הוא תא חסיד Murine פיברובלסטים קו, שלא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ.

1. הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה.
2. הוסף 4 מ"ל טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ ² למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים.
3. הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות.
4. מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
5. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים:
   1. 1.5 x 10 ⁶ תאים subculturing
   2. 0.2 x 10 ⁶ תאים / היטב הקרנה המשמש תרבות CD40-B לתא
   3. שאר להקפיא (במידת הצורך).
6. ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
7. הסר את supernatant.
   1. עבור subculturing: resuspend 1.5 x 10 ⁶ תאים 10 מ"ל בינוני בר להקליד 75 ס"מ ² בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 1.5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל), מוסיפים G-418 [0.7 מ"ג / מ"ל] ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO _2. פיצול התאים פעמיים בשבוע.
   2. במשך תרבות CD40-B התא: אתה צריך 1.2 x 10 ⁶ תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים בינוני סוג בר בצפיפות של 0.1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO _2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tCD40L NIH/3T3 תאים חסיד (לפחות 4 שעות: הדבקות לבדוק עם מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב)

ב 40 CD-B תרבית תאים

I. הכנת PBMCs לגירוי-CD40 (יום 0):

שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טריים של interleukin-4 ו ציקלוספורין למדיום הגידול מיד לפני השימוש.

1. קח PBMCs, או טרי או מופשר כראוי. Resuspend PBMCs פעמיים 50 מ"ל של 1x PBS לשטוף אותם ספין למטה בפעם הראשונה ב XG 265 דקות 7 ופעם שנייה ב XG 190 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 20 מ"ל של PBS. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא.
2. ספין למטה הכמות הנדרשת של תאים ב XG 225 דקות 5. עבור צלחת 6-באר 4 x 10 ⁶ תאים / גם יש צורך, ובכך 24 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת.
3. הסר את supernatant ו resuspend PBMC ב 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום CD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 50 U / mL של interleukin-4 כגורם צמיחה 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תוצאה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!).
4. הסר את supernatant מ 6 גם צלחת מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
5. שטפו את חסיד tCD40L NIH/3T3 תאים עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.
6. בעדינות להוסיף 4 מ"ל של השעיה PBMC (1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
7. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO _2.
8. ביום 7, reculture התאים (המשך 3.2.).

השנייה. Recultivation של CD40-B תאים (יום 7 ואז כל 3-4 ימים):

1. הבציר אשכולות של CD40 בתאי B-6-מהצלחת היטב על ידי resuspending עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל.
2. ספין למטה XG 225 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום CD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 225 במשך 5 דקות. Resuspend CD40 בתאי B-בינוני CD40 B-תרבות בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
3. הוספת פתרונות טריים של interleukin-4 בריכוז של 50 U / mL ו - 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ​​ציקלוספורין למדיום.
4. הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
5. לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.
6. בעדינות להוסיף 4 מ"ל (1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) של השעיה CD40-B היטב בכל צלחת 6-הבאר.
7. דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO ^2.
8. תאים תת שוב כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים אנושיים B לאחר סך של 14 ימים.

ג בעיות הירי - מה אם תאים CD40-B אינם גדלים?

1. בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין?
2. צלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי לא צריך להיות מעל גיל 24 שעות?
3. האם זיהום אפשרי עם mycoplasma?
4. האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי והיה לו את הפעילות הביולוגית המתאים?
5. האם ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון?

באיור 1. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
תא מזין בינוני סוג בר		תא מזין מבחר בינוני
מגיב	ריכוז	מגיב	ריכוז
DMEM-Ham של / F12		DMEM-Ham של / F12
L-גלוטמין	365 מיקרוגרם / מ"ל	L-גלוטמין	365 מיקרוגרם / מ"ל
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל	Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל
		G-418	0.7 מ"ג / מ"ל

CD40-B בינוני כביסה		CD40-B בינוני תרבות
מגיב	ריכוז	מגיב	ריכוז
IMDM		IMDM
L-גלוטמין	584 מיקרוגרם / מ"ל	L-גלוטמין	584 מיקרוגרם / מ"ל
HEPES	25 מ"מ	HEPES	25 מ"מ
Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל	Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל
		RH transferrin	50 מיקרוגרם / מ"ל
		RH אינסולין	5 מיקרוגרם / מ"ל
		AB-Humanserum	10%

מגיב	חברה	אין סדר
DMEM / חם של F12	PAA	לא חתול: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
Dulbecco של PBS (10x)	PAA	חתול לא H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	חתול לא 34005100
הולוגרמות transferrin אדם	סיגמא	חתול לא T0665
אינסולין אנושי	סיגמא	חתול לא I2643
Gencin ®	דלתא בחר	לאמנות אין 7395800
אינטרלויקין 4 האדם רקומביננטי	Immunotools	חתול לא 11130045
ציקלוספורין	נוברטיס	חתול לא 0078-0109-01 NDC
FBS	Lonza	חתול לא DE14-802C
HEPES הצפת	PAA	חתול לא S11-001
G-418 סולפט	PAA	חתול לא P02-012
טריפסין / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

מגיב	חברה	אין סדר
סטרילי פיפטה טיפים	Sarstedt
6 גם צלחת	NUNC	חתול לא 140675
50 מ"ל צינור חרוטי	BD פלקון ™	חתול לא 352070
תרבות רקמות צפחת	SARSTEDT	חתול לא 83.1813.002