דגם Murine עבור מחלת פרקינסון: מן הנגע 6-OH דופמין מבחן ההתנהגות

Summary

מחלת פרקינסון נגרמת על ידי אובדן של העצבוב דופאמין אל הסטריאטום, אשר יכול להיגרם בניסוי על ידי 6 דופמין-OH. אנו מתארים כיצד לבצע הנגע stereotaxic כדי לפקח הידרוכלורידי-Induced התנהגות הסיבוב בעכברים. מודל זה שימושי ואמין לבדיקה טיפולים חדשים למחלת פרקינסון.

Abstract

מחלת הפרקינסון (PD) משפיע על לפחות 6,500,000 בני אדם ברחבי העולם, ללא הבדל מין, גבולות חברתיים, כלכליים או גיאוגרפיים. תסמינים עיקריים, כגון קשיחות רעד, ו bradikinesia, לפתח כאשר כ 3 / 4 של תאים דופאמינרגיים יאבדו את nigra substantia, ולא מצליחים לספק להסדרת חלקה ומתואמת של מעגלים מנוע striatal. דיכאון הזיות נפוצים, ודמנציה בסופו של דבר מתרחשת אצל 20% מהחולים. בשלב זה, אין טיפול לעכב או לעצור את ההתקדמות של מחלת הפרקינסון. במקום זאת, תרופות המטרה זמין כרגע יותר לכיוון להקל על תסמינים אלו. אסטרטגיות כירורגית ניו הפיך עשוי לעבור על מעגלים פגום מבחינה תפקודית באמצעות גירוי חשמלי של מבנים מוחיים עמוקים, אך למרות גירוי מוחי עמוק הוא התקדמות גדולה, זה לא מתאים לכל החולים. נותר אפוא צורך לבחון גישות חדשות בטיפול תא במודלים פרה.

שיבוש neurotoxic סלקטיבי של מסלולים דופאמין ניתן לשחזר על ידי הזרקה של hydroxydopamine-6 ​​(6 OHDA) או MPTP (1-methyl-4-פניל-1-,2,3,6 tertahydropyridine) ואילו depleting סמים חמצוני מזיק כימיקלים עשויה גם להתרבות תכונות ספציפיות של פ"ד במכרסמים. בניגוד MPTP, 6-OHDA נגעים לגרום לאובדן מסיבי עצבי בלתי הפיך, והוא יכול להיות חד או דו צדדי. המודל 6-OHDA הנגע הוא אמין, מוביל גירעונות מנוע חזק, והיא הנפוצה ביותר rats1 לאחר 40 שנים של מחקר. כמו יחסי הגומלין בין תאים מורכבים מארח כעת ניתן ללמוד באופן יסודי יותר בעכברים מאשר בחולדות, המודל כבר משורבב ל ^2,3 עכברים, בו התאפיינה לאחרונה ^4.

בסרטון זה אנו מדגימים כיצד הנגע מסלול שמאל הכושי-striatal של עכברים הרדים ידי לאט ומספק 2.0 μL של 6-OHDA באמצעות מחט המזרק מוכנס מיקרו stereotaxically. ההפסד של דופאמין קלט מתרחשת בתוך ימים, ליקויי פונקציונלי יכול להיות פיקוח על שלאחר הניתוח שבועות וחודשים על ידי בעלי חיים סיבובים דירוג המושרה על ידי סוכני דופאמין ^5. כאן, אנו מציגים גוף מלא סיבובים הנגדי המתרחשים 10 דקות לאחר מתן תת עורית אחת של הידרוכלורידי, נמדד כחודש לאחר הפגיעה. התוצאות והחסרונות נדונים להלן.

Protocol

כימיקלים כל מאוחסנים בצורת מוצק, כגון 6-OHDA ו הידרוכלורידי, היו מדולל במים מסוננים הזרקה סטרילי בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום. בנוסף, neurotoxins וחומרים neuroactive אוחסנו, מוכן, טיפל להיפטר פי התקנות שנקבעו על ידי הנחיות בינלאומיות ⁶ ו biosafety הוועדה המקומית.

1 - הרדמה וניתוח

למבוגרים עכברים השוויצרי גבר (25-30G) הם premedicated עם אטרופין (0.2 מ"ג / ק"ג, sc) כדי להפחית את הטון ואת מחנק הרדים אז עם זריקה intraperitoneal של קטמין (90-120 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) . חיה ממוקמת על משטח חימום מבוקר אלקטרונית (Insight) כדי להבטיח טמפרטורת הגוף נשמר 37 ° C, כמו אינדוקציה של הרגעה לוקח כמה דקות. רמת הרדמה נבדק לאורך ההליך על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה. מינון ההרדמה צריך להיות ajusted עבור כל זן / המושבה. בהתאם החיה ומשך הניתוח, מינונים נוספים של קטמין עשוי להיות נחוץ. אחרי זה, מי מלח (NaCl 0,9%) מוחל על שתי העיניים כדי להגן על קרניות מהתייבשות ולבדוק את העדר רפלקס למצמץ ברגע זה הראשון. הפרווה על הראש כולו מגולח עם גוזם כדי להבטיח את מגע מינימלי עם אזורים unsterile. הרדמה מקומית (Xylocaine) על הסורגים האוזן כדי למנוע סבל. רק פעם אחת נסיגה רפלקס למצמץ נעלמו, המציין את רמת ההרדמה היא עמוקה מספיק לניתוח (שלב 3), החיה ממוקם על מסגרת stereotaxic באמצעות הפה חתיכת וברים האוזן תוכנן במיוחד עבור מין זה (Insight). Positionated פעם, משחה ophthalmologic (Marca) מוחל על מנת להגן על העיניים חיה לאורך כל הניתוח. רק לאחר להיות בטוח כי בעיני מוגנים כראוי, ההליך להמשיך עם החיטוי של העור באזור הניתוח על ידי חזרה על שלושה יישומים של יוד povidone ואחריו אתנול 70%, באמצעות ספוגיות כותנה סטרילי אחרי, מיקום נכון של הסורגים האוזן מובטחת על ידי בדיקת תנועות הצידה של הראש (הראש לא צריך לזוז כדי להבטיח את הסורגים הם קבועים היטב). הנטייה dorsoventral נכונה של הראש יאומת מאוחר יותר, כאשר מתגלים סימני דרך הגולגולת. חתך sagittal (1.5 ס"מ) הוא עשה עם אזמל סטרילי (# 15 להב). Periosteum על פני שטח של עניין הוא שרט בעדינות עם להב חדש, העצם נמחק במבט סטרילי ספוגיות כותנה, כדי לחשוף ציוני דרך הגולגולת: גבחת מוגדרת כנקודת החיתוך של התפרים sagittal ו העטרה, בעוד למבדה היא נקודת החיתוך של תפר sagittal וקו בכושר הטוב ביותר עובר דרך חלקים על ימין ועל שמאל של תפר lambdoid. קצה של מחט התייחסות בציר אנכי הוא התביית הראשון גבחת, תחת בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, ולאחר מכן עבר כמו לגעת בנקודה למבדה. אם הראש ממוקם כראוי, למבדה צריכה להיות ברמה dorso-הגחון כמו גבחת, וציוני דרך שניהם צריכים להיות רחוקים ידי מ"מ 4.2 לאורך ציר rostro-הזנב. אם לא, האוזניים ברים nosepiece יש לשחרר ואת הראש מוטה בעדינות סביב ציר interaural, על מנת להשיג את המיקום הרצוי, המגדיר את "גולגולת שטוחה" התייחסות אמצעים stereotaxical. קצה המחט התייחסות ממוקם אז קואורדינטות הרצוי: קדמית, אחורית (AP 0.5 מ"מ) לרוחב (L -2.0 מ"מ, משמאל). המקום מסומן על הגולגולת חור קטן (בקוטר 1.2 מ"מ) נפתח עם קצת לקדוח מעוקרים, באמצעות פעולה לסירוגין, כדי למנוע החום באזור. שברי עצם מוסרים בזהירות עם מגרד שיניים ושטפה עם סטרילי NaCl 0.9% חם. מעוקר 5 μl המילטון מזרק (26s מד; בקוטר 0.47 מ"מ החיצוני) הוא טעון עם פתרון 6-OHDA (או ברכב לבעלי חיים שליטה) ו בציר אנכי המנגנון stereotaxic. קצה המחט (סוג 2 או 12 שפוע °) מוכנס לתוך החור ואז נפתחה, עד לגעת במשטח pial, כדי דטרמיניסטיות נקודת ההתייחסות של לתאם dorso-הגחון. לאחר דטרמיניסטיות זה לתאם, המחט יורדת לאט להגיע הקואורדינטות של בסטריאטום (AP: 0.5; L: -2.0 ו DV: מ"מ -3.0, מתחת לפני השטח pial ^7). הפתרון 6-OHDA (10 מיקרוגרם 6-OHDA ב NaCl 0.9% עם חומצה אסקורבית 0.02%), אשר הוכנה מסוננים בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, והוא חייב להיות מוגן מפני אור על ידי רדיד אלומיניום לאורך ההליך, מוזרק אז קצב הזרימה של 0.1μL/min. עבור בעלי חיים שליטה, נפח שווה של כלי רכב (0.02% חומצה אסקורבית ו -0.9% NaCl במים סטריליים) מוזרק. לאחר μL כולו 2.0 כבר הזריק, המזרק נשמר מקום 5 דקות לפני שהם מאוד לאט חזר בו מן המוח, לא פחות מאשר 5 דקות. הגולגולת היא לנקות את החתך נסגר באמצעות תפרים # 6-0 ניילון (שלון). כדי לקחת תוספתטיפול נגד זיהום, משחה אנטיביוטית מקומית, כמו neomycin, ניתן להחיל על העור sutured. בעלי חיים יוסרו מן המסגרת, בהתחשב 0.5 מ"ל של תמיסת מלח (sc.) על מנת למנוע התייבשות, והמשיך חמים תחת השגחה צמודה עד להחלמה מלאה. הם שוכנו אז עם מזון כרצונך מים. משככי כאבים מתווסף בקבוק שתייה עבור היומיים הראשונים לאחר הניתוח (נתון ממוצע צריכת המים היומית של 5.5 מ"ל, ואת המינון המומלץ של איבופרופן 0.03 מ"ג / גרם של משקל גוף / יום; להוסיף 0,82 מ"ל של 20 מ"ג / mL איבופרופן-אבוט ההשעיה למים לשתייה 100 מ"ל). עכברים בדרך כלל להתאושש במהירות מן ההליך, נדודים והגעה עבור כדורי מזון, מים בקלות. בכל מקרה של אי נוחות נראית לעין, או כל סימן לזיהום, בעלי חיים צריכים להיות מורדמים בהתאם להנחיות המקומיות.

2 - מבחן ההתנהגות

למרות פגיעה מוטורית ניתן לראות אחרי שבוע, מרווח שלאחר הנגע של חודש אחד מותר לפני כימות אמין במבחן הסיבוב. חיים מקבל זריקה תת עורית של הידרוכלורידי אגוניסט התובע (0.5 מ"ג / ק"ג), והוא ממוקם אטום של גליל בקוטר 30 ס"מ, 45 ס"מ מתחת להציב מצלמה ההקלטה. חשוב להסיר שאריות וריחות מחיות נבדק קודם לכן לפני כל בדיקה. לאחר תקופת התרגלות 5 דקות, התנועות נרשמות על פרק זמן 5 דקות. קונטרה ו סיבוב שני ipsilateral גוף מלא נמדדים בהשוואה לקבוצת הביקורת (הרכב מוזרק). אם ההליך בוצע כהלכה, חיות בקרת לא יציגו כל סיבוב, ואילו 6-OHDA חיות lesioned יתחיל להפוך לצד הנגדי, שכן אגוניסט בעיקר מפעיל את הסטריאטום denervated רגיש בצד lesioned. בעלי חיים ניקוד מעל 7 סל"ד (הצגת לפחות 7 גוף מלא הנגדי סיבובים לדקה) נחשבים lesioned בהצלחה. בעלי חיים ניתן חזרו בשלום שלהם 30 דקות דיור לאחר הבדיקה, אשר ניתן לחזור לשבוע. בידיים שלנו, פחות מ -5% של עכברים lesioned מוצגים שיעורי הסיבוב הכי מוצלח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הנגע חד צדדית נרחבת של מסלול הכושי-striatal יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת אמין stereotaxic יחיד של 6-OHDA לתוך בסטריאטום בעכברים. היקף הפגיעה ניתן לאמת שלאחר המוות ע"י אימונוהיסטוכימיה עבור hydroxylase טירוזין (אשר catalyses שיעור הגבלת שלב של הסינתזה של התובע, כלומר המרה של L-tyrosine כדי di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride	König		90-120 mg/Kg
Xylazine hydrochloride	König		10 mg/Kg
Atropine Sulfate	Isofarma		Isofarma
6 – Hydroxydopamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich		5 μg/μL
L - Ascorbic Acid	USB Corp., Affymetrix		0.2%
Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)	AstraZeneca		5% 50 mg
Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)	Altana Pharma		5 mg/g + 250 Ul/g
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg
GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose	Novartis AG		0.33%
Ibuprofen	Abbott Laboratories		4 mg/ 100 ml drinking water
Povidine	Johnson Diversey
R-(-)-Apomorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich		0.5 mg/Kg