Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

Summary

מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.

Abstract

כדי לתפוס פתוגנים פוטנציאליים בסביבה שלהם, הצמחים להשתמש זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) בהווה על ממברנות פלזמה שלהם. PRRs להכיר תכונות חיידקים נשמרת בשם הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) וגילוי זה מוביל חסינות PAMP-מופעלות (PTI), אשר למעשה מונע קולוניזציה של רקמות הצמח על ידי ^1,2 שאינם פתוגנים. מערכת ביותר למד היטב PTI הוא ³ FLS2 תלוי מסלול. FLS2 מכירה flg22 PAMP כי הוא רכיב של flagellin חיידקי.

פתוגנים מצליחים להחזיק גורמים ארסיות או effectors שיכולים לדכא PTI ולאפשר הפתוגן לגרום למחלה ^1. יש צמחים בעלי גנים להפוך התנגדות המאתרות effectors או הפעילות שלהם, מה שמוביל חסינות מפעיל-מופעלות (אתי) ^2.

אנו מתארים מוות מבוססי תאים assay עבור PTI שונה מ הו ו Collmer ^4. Assay היתה סטנדרטית ב נ benthamiana, אשר נמצא בשימוש יותר ויותר כמערכת מודל לחקר יחסי גומלין צמח פתוגן ^5. PTI הוא המושרה על ידי חדירה של זן לא פתוגני חיידקי לתוך העלים. שבע שעות מאוחר יותר, זן חיידקי או מחלה או גורם אשר מפעילה אתי הוא הסתנן לאזור חופפות את אזור החדירה המקורי. PTI הנגרמת על ידי חדירת הראשון הוא מסוגל לעכב או למנוע את המראה של מוות של תאים עקב חדירת האתגר השני. לעומת זאת, את המראה של מוות של תאים באזור חופפים של חיסון מציין פירוט של PTI.

ארבעה שילובים שונים של מעוררים של PTI וכן חיסונים אתגר היו סטנדרטיים (טבלה 1). Assay נבדקה על אי - השתיק נ benthamiana צמחים ששימשו לשלוט וצמחים השתיק עבור FLS2 אשר נחזו להיות פגיעה ביכולתם לפתח PTI.

Protocol

חלק 1: גידול הצמח תחזוקה

ניקוטיאנה benthamiana צמחים המשמשים assay צריך להיות כ 7 שבועות. הם צריכים להיות גזומים לפחות 4-5 ימים לפני assay כדי להסיר כל ענפי השחי ופרחים. זה רעיון טוב להוציא סניפים בבית השחי מיד אחרי שהם יוצאים כדי להפוך את הצמחים יותר לניהול.

חלק 2: תרבות חיידקית

יום 1:

1. פלטות או תרבויות לכל זני המשמש assay הם יזמו באותו זמן. עבור Pseudomonas spp. אשר כוללים 2 ו - 3 זנים מעוררים אתגר, חיידקים על גבי צלחות פס KBM המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה מתוך מניות גליצרול קפוא (טבלה 2). כמות קטנה של חיידקים צריך להתפשט במרכז הצלחת. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 18-24 שעות. עבור Agrobacterium, להתחיל תרבות נוזלי LB 2 מ"ל מהצלחת טרי לגדול בין לילה ב 250 סל"ד, 30 ° C.

יום 2:

2. עבור Pseudomonas, להוסיף 150-200 μl של KBM נוזל החיידקים ולהפיץ אותם מעל צלחת כולו באמצעות מפזר זכוכית סטרילית. שים את הצלחת בחזרה בחממה ולתת לו לגדול עוד 20-24 שעות. לא צריך להיות דשא בקטריאלי על הצלחת למחרת, המעיד על צמיחה טוב. עבור Agrobacterium, להתחיל התרבות משנית LB על 5-10 מ"ל עם acetosyringone 20 מיקרומטר ולתת לו לגדול בין לילה עד 20 שעות 250 סל"ד, 30 ° C.

חלק 3: צמחים הכנה assay

יום 2:

1. יום אחד לפני assay הצמחים יש להעביר לחדר בבית 22-24 ° C, ~ 35-40% לחות יחסית קל וקבוע.
2. מרק עיגולים על העלים לפחות 1.5 ס"מ קוטר באמצעות בטוש שחור עבה. שניים עד ארבעה עיגולים ניתן לסמן לכל עלה. חוגים צריכה להיות מחולקת היטב ועדיף לא לחצות וריד גדול. בחר היטב מורחבת עלים. הימנע עלים מבוגרים או עלים קשים או עבה לגעת ולהימנע סימון חוגים על חלקים התחתון של העלה.

חוגים לציון יום לפני הניסוי אינו חיוני בפרוטוקול. עם זאת, זה חוסך זמן אם יש מספר גדול של צמחים להיות assayed, ומקלה על מנת להשיג תזמון מדויק בין אינדוקציה של PTI וכן חיסונים אתגר.

חלק 4: אינדוקציה של PTI

יום 3:

1. קציר התאים מהצלחת של 10 mM MgCl ₂ עבור fluorescens פ ו פ putida. עבור Agrobacterium, צנטריפוגה התרבות לאסוף תאים resuspend ב 10mm MgCl ₂ + 10 mM MES-pH 5.6. חזור על צנטריפוגה ו resuspend בפתרון _2-MES MgCl. מדוד את צפיפות אופטית (OD) של תאים ב 600 ננומטר. התאם את מכנסי הש"כ לערכים הנדרשים הסופי כפי שמתואר בטבלה 2. Pseudomonas צריך להיות resuspended לבסוף 10 מ"מ MgCl ₂ ו Agrobacterium של MgCl _2-MES פתרון. הנפח הכולל של 25 מ"ל מספיקה כדי לחסן על 40-50 נקודות.
2. הסתנן מעוררים PTI לתוך מראש סימנה עיגולים על העלים באמצעות מזרק 1 מ"ל ללא מחטים. רשמו את הסדר שבו הצמחים היו הסתננו ואת הזמן המדויק שבו החלה הסתננות.

חלק 5: חיסון אתגר

1. הכן פ syringae pv. עגבניה DC3000, PST DC3000 Δ hopQ1-1 ו-PV תהלים. tabaci לאתגר כמתואר בחלק 4.1 ולוח 2.
2. שבע שעות לאחר החדירה inducer, לבצע את החדירה אתגר באותו סדר של צמחים כמו הגיוס נעשה. בדרך כלל, נקודת בשולי המעגל חיסון הראשון יכול לשמש מרכז המעגל הרכבה השני. אם ישנם כתמים רבים על עלה מכן ודא חדירות אינם חופפים.
3. פלייט דילולים הסידורי של כל התרבויות השתמשו assay על צלחות KBM או LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לקבוע את המספר המדויק CFU.

חלק 6: ניקוד עבור פירוט של PTI

יום 5:

1. חפש הופעתו של מוות של תאים עקב אתי במקומות שהיו תיגר עם Pst DC3000. מוות של תאים בתוך שטח חופף של חדירת מציין פירוט של PTI ויש הבקיע כמו פנוטיפ חיובית.

יום 7:

2. חפש הופעתו של מוות של תאים עקב מחלת במקומות שהיו תיגר עם Pst DC3000 Δ hopQ1-1 או תהלים pv. Tabaci . ציון עבור פנוטיפ חיובית באותו אופן כפי שתואר בחלק 6.1.

כאשר הצמחים הביקורת (שלא צריך להתפשר על PTI) מתחילים להראות מוות של תאים באזור חופפים החדירה, להפסיק ביצוע תצפיות נוספות.

חלק 7: תוצאות נציג

איור 1 מציג את תוצאות assay כאשר פ fluorescens שימש inducer ו DC3000 Pst כאתגר.

באיור 1. פ fluorescens היה הסתננו אל נ benthamiana עלים (עיגול שחור) כדי לגרום PTI ו -7 שעות לאחר מכן, המקום היה תיגר עם Pst DC3000 (עיגול לבן). צמחים השתיק עבור FLS2 הראה פירוט של PTI באזור שבו פ fluorescens היה הסתננו (א), כפי שניתן לראות על ידי מוות של תאים. צמחים בקרה שלא הושתקו לא הראה שום מוות של תאים באזור חופפים בשל גיוס של PTI (B). החצים האדומים מצביעים על העדר או נוכחות של מוות של תאים באזור חופפים של חדירה. התמונות צולמו ימים לאחר 2 חדירות. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.

PTI inducer	Cell מוות לעורר אתגר	הטבע של מוות של תאים	קוד
Pseudomonas fluorescens 55	Pseudomonas syringae pv עגבניות (PST). DC3000 6	אתי	PF / DC
פ putida KT2440	Pst DC3000	אתי	Pp / DC
פ fluorescens 55	Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6	מחלה	Pf/Q1-1
Agrobacterium tumefaciens GV2260	פ syringae pv. tabaci 11528R	מחלה	אגרו / Ptab

טבלה 1: שילובים של גרימת PTI ותא מוות לעורר חיידקים המשמשים assay התא למוות PTI.

זן חיידקי	מבחר בינוני	סופי OD השתמשו בניסוי	מקבילים CFU / ml
פ fluorescens 55	KBM אמפיצילין (100 UG / ml)	0.5	1 x 10 9
פ putida KT2440	KBM אמפיצילין (100 UG / ml)	0.5	1 x 10 8
א tumefaciens GV2260	LB ריפמפיצין (100 UG / ml)	0.5	5 x 10 8
Pst DC3000	KBM ריפמפיצין (100 UG / ml)	0.02	2 x 10 7
Pst DC3000 Δ hopQ1-1	KBM ריפמפיצין (100 UG / ml)	100 דילול של פי 0.1	1 x 10 6
פ syringae pv. tabaci 11528R	KBM ריפמפיצין (100 UG / ml)	100 דילול של פי 0.1	1 x 10 6

טבלה 2: התנאים התרבות רמות inoculum בשימוש assay. OD ו המקביל רמות CFU עשוי להשתנות בין מותגים שונים של הספקטרופוטומטרים.

Discussion

התא assay מוות מבוססי ניתן להשתמש כדי לקבוע את מעורבותם של גנים ב PTI. למשל, הפסד של פונקציה מוטציות של הגן של עניין, ניתן לבדוק באמצעות assay. מתוך 4 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר נתון בטבלה 1, זה אפשרי, כי רק שילוב אחד עלול לגרום פנוטיפ ברקע המפעל שלך. ראינו כי הצמחים השתיק עבור FLS2 להראות פירוט של PTI ב PF / DC ו Pf/Q1-1 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר (טבלה 1).

זה חיוני כי התנאים הסביבתיים עבור assay הם קרוב ככל האפשר לאלה המתוארים בפרק 3.1. לחות נמוכה גורמת למוות התא להתקדם מהר מדי, מה שהופך assay קשה להבקיע. אם התנאים המתוארים בפרוטוקול שלנו לא עובדים במעבדה שלך, ואז לנסות לשנות את רמת inducer או חיסון אתגר. פרמטר נוסף אשר יכול להיות שונה הוא פער הזמן בין אינדוקציה אתגר, אם כי מצאנו כי פערי זמן קצר גרם assay להישבר מהר מדי בצמחים שליטה.

אנו ממליצים כי לפחות 4-5 צמחים להיבדק בניסוי לבין פנוטיפ חיובית יש לחזור לפחות ניסויים עצמאיים 3-4.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES	Fisher Scientific	BP300-100	Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature.
Life Science UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter Inc.	DU 730