הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

Summary

Neurexins ו neuroligins הם קרום תא עצב הידבקות חלבונים אשר מבצעים תפקידים חיוניים בידול הילוכים הסינפטי ו. Neuroligin מוטנטים לקוי של ג elegans פגומים באיתור כוח אוסמוטי, אך כאשר הם גם מכילים מוטציה בגן המקודד neurexin, הם לשחזר את הפנוטיפ סוג בר.

Abstract

Neurexins ו neuroligins הם מולקולות הדבקה תא נוכח סינפסות מעוררות ו מעכבות, והם נדרשים לתפקוד נוירון לתקן רשת ^1. חלבונים אלו נמצאים על ממברנות presynaptic ו postsynaptic ^2. מחקרים בעכברים מעידים כי neurexins ו neurologins יש תפקיד חיוני בשידור סינפטי ^1. דיווחים אחרונים הראו כי קשרים עצביים שינו במהלך הפיתוח של מערכת העצבים האנושית, להוות בסיס האטיולוגיה של מקרים רבים של ספקטרום האוטיזם ^3.

Caenorhabditis elegans יכולה לשמש ככלי ניסיוני כדי להקל על לימוד של תפקוד של רכיבים סינפטיים, בגלל פשטותה ניסויים במעבדה, וכן בהתחשב בכך שמערכת העצבים שלו החיווט הסינפטי התאפיינה באופן מלא. ב-C. Elegans nrx-1 ו-1 NLG גנים orthologous כדי NRXN1 ו NLGN1 הגנים האנושיים המקודדים אלפא neurexin-1 ו-1 neuroligin חלבונים, בהתאמה. בבני אדם נמטודות, ארגון neurexins ו neuroligins דומה מבחינה לתחומים פונקציונליים.

ראש נמטודות מכיל את amphid, איבר חושי של נמטודות, אשר מתווכת לתגובות לגירויים שונים, כולל כוח אוסמוטי. Amphid עשוי 12 נוירונים דו קוטבית חושית עם דנדריטים ריסי אחד האקסון מסוף presynaptic ^4. שניים מהם נוירונים, בשם ASHR ו ASHL חשובים במיוחד התפקוד החושי האוסמוטי, גילוי מסיסים במים דוחי עם כוח אוסמוטי גבוה ^5. דנדריטים של שני נוירונים להאריך לקצה הפה האקסונים להאריך לזירה עצב, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים אחרים לקבוע את התגובה ההתנהגותית ^6.

כדי להעריך את ההשלכות של neurexin ו neuroligin ב והימנעות גבוה כוח אוסמוטי, אנו מראים את התגובה שונים של C. elegans מוטנטים פגום nrx-1 ו-1 NLG גנים, באמצעות שיטה המבוססת על טבעת פרוקטוז 4M ^7. פנוטיפים התנהגותיים אושרו באמצעות שיבוטים RNAi ספציפיות ^8. ב ג elegans, dsRNA הנדרש להפעלת RNAi יכול להיות מנוהל על ידי האכלה ^9. מסירת dsRNA דרך מזון גורם הפרעה RNAi של הגן של עניין ובכך מאפשר זיהוי של רכיבים גנטיים מסלולים הרשת.

Protocol

1: assay הימנעות אוסמוטי.

1. כ 16-24 שעות לפני assay, לאסוף חיות L4 בשלב הזחל של גנוטיפ לכל צלחת NGM טרי המכיל OP50 E. coli andincubate אותו 20 ° C. למחרת להתחיל את הניסוי עם צעירים.
2. מומלץ לבצע את assay "עיוורת". הצלחות עם זן אחד להיות assayed צריך להיות relabelled ידי הנסיין השני, ביצוע assay באמצעות צלחות relabelled זה יהיה הניסוי חשף כאשר סיימה.
3. יום של assay, להכין פתרון מניות 4M של פרוקטוז עם פתרון 1% האדום קונגו להתמוסס לחלוטין בטמפרטורת החדר. אנו ממליצים לבדוק את הפתרון לפני assay כל שכן צבע יכול להאיץ עם הזמן.
4. טבעת טבעתי (1 ס"מ קוטר) על הצלחת NGM מתוארת על מרכז של המדיום מוצק, עם 15 μl של הפתרון 4M אדום פרוקטוז. תנו פתרון פרוקטוז לספוג לתוך אגר, זה בדרך כלל לוקח בין 2 ל 5 דקות.
5. המקום היחיד בעלי חיים בוגרים צעירים של זן אחד בתוך הטבעת ופעל על הבא 10 דקות כדי לקבוע את התגובה המכשול האוסמוטי. בעלי חיים הימנעות את הטבעת יותר משש פעמים ברציפות מסווגים נורמלי; אלה שפרשו את הטבעת פחות משישה ניסיונות נחשבים פגומים ברגישות האוסמוטי.
   הערה: זן השליטה יש להשתמש assay כל אחד. בעלי חיים N2 הבוגרים הצעירים משמשים שולטת חיובית כפי שהם בנחישות למנוע את מחסום טבעת. חיות שהיו מורעבים בעבר, עברו הזחלים Dauer או באים צלחות יבש מדי, כי הם לא צריכים להיות בשימוש. בהתחלה, חיות בקרת יש להעריך כפולות, כדי לאשר את הלוחות assay והפתרון נכונים.

2: הדור של תולעים מציאה על ידי האכלה RNAi.

1. RNAi צלחות: NGM צלחות RNAi האכלה מכיל לליטר: 17 גרם אגר, 2,5 peptone גרם, 3.0 גרם NaCl, 1 מ"ל של 5 מ"ג כולסטרול ^-1 מ"ל; למלא את הבקבוק 1 ליטר עם H ₂ O ו - החיטוי. אחרי אגר מתקרר כ 65 ° C, להוסיף 25 מ"ל של 1 M KPO _4, pH 6.0, 1 מ"ל של 1 M CaCl _2, 1 מ"ל של 1M MgSO _4, 0,5 carbenicillin מ"ל (50 מ"ג ^-1 מ"ל) ו 1 IPTG מ"ל 1M. אם אתה מתחיל עם NGM מוצק מוכן, להמיס בינוני מוצק על ידי במיקרוגל ולאחר מכן מקום NGM נוזלי על הספסל להתקרר ולאחר מכן להוסיף KPO _4, pH 6.0, CaCl _2, MgSO _4, carbenicillin ו IPTG כפי שצוין קודם לכן.
   
   הוסף 10 מ"ל של NGM לתוך צלחת פטרי כל 60 מ"מ. לאפשר קירור להפוך צלחות שמירה על אותם RT לילה לפני השימוש. פלטות יכול להיות מאוחסן בתוך שקית פלסטיק על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 4-5 ימים.
2. הכנה חיידקים אינדוקציה: לבודד מושבות של E.coli HT115 (DE3) מתח, הפך עם וקטור L4440 המכיל שבר המתאים הגן היעד, על לוריא-Bertani (LB) צלחות אגר (17 אגר גרם, 10 גרם tryptone, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם לליטר NaCl) המכיל אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו tetracyclin (15 מיקרוגרם / מ"ל).
   
   פיק מושבה של חיידקים לתוך לחסן LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין, גדל במשך 6 שעות 8 עם רועד ב 37 ° C; הזרע ירידה של תרבות זו על גבי צלחות NGM מוכן ויבש צלחות ביסודיות בטרם דוגרים לילה ( 12 24 שעות) בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לחיידקים לגדול להתחיל אינדוקציה. הדגירה היה בחושך כי טטרציקלין אור רגיש זה עלול להשפיע על השתנות של מבחני RNAi בין הצלחות.
   
   זה הכרחי להשתמש חיובית שליטה שלילי עבור ניסויים RNAi האכלה. הבקרה החיובית היא E.coli HT115 תא שינה עם וקטור L4440 המכיל את רצף UNC-22 גנים. מציאה של הגן 22-UNC מייצרת "פנוטיפ עוויתות". השליטה שלילי E.coli HT115 תא שינה עם וקטור L4440 ריק.
3. טיפול תולעת ו ניקוד: היום הראשון, מקום L4 הבמה תולעים מהצלחת NGM seeded עם OP50 לצלחות NGM ללא חיידקים לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות (בצום).
   
   למחרת, להעביר צעיר הרמפרודיטים מבוגר צם לצלחת seedded עם חיידקים להביע היעד הספציפי גן RNAi. השאירו 40-48 שעות 20 ° C כדי לייצר צאצאים F1.
   
   אז במקום תולעים כמה בוגרים F1 לצלחת נוספת עם זורעים את החיידקים זהה. לאחר 24-48 שעות, בחר לבודד מן הצאצאים F2, צעירים (הפות בולטות נוצר באופן מלא עם כמה ביצים) ואת הציון של פנוטיפים.
   
   הערה: אינדוקציה RNAi בנוירונים יש מגבלות בגלל המאפיינים עקשן של מערכת העצבים elegans C RNAi.. כדי להתגבר על בעיות של חוסר יעילות זה נוירון מומלץ להשתמש זן rrf-3, רקע רגישות יתר להשפעות של RNAi בנוירונים ^10. בניסויים שלנו לא differences נמצאו בין בריסטול N2 ו rrf-3 זנים של הגנים לבין פנוטיפ ניתחו.

3: מתחים בשימוש.

ג זנים elegans המשמשים בעבודה זו מוצגים בלוח 1. זנים Mutant היו מחוץ חצה נגד N2 בר - סוג לפחות ארבע פעמים להסיר מוטציות אקראיות רצויים שהיו יכולים שנוצר במהלך הפרוטוקול mutagenesis.

. OP50 E coli זן היה suppliied ידי Caenorhabditis גנטית מרכז, מאוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב E.coli HT115 (DE3) עם pL4440 פלסמיד שנשא nrx-1 (JA: C29A12.5). NLG ו-1 (JA: C40C9.5 ) שברי גן סופקו על ידי ד"ר פיטר Askjaer, Centro de Andaluz Biología דל Desarrollo (CABD), CSIC Universidad פבלו Olavide, סביליה, ספרד.

4: תוצאות נציג.

תוצאות להמחשה מיוצגים איורים 1 ו -2. עשר החיות של זן כל מינימום של שלושה ניסויים העתק בוצעו.

באיור 1. ניסויים של התנהגות ההימנעות האוסמוטי.
זנים בקרה nrx-1 (ok1649 ו tm1961) mutantworms V לקוי להגיב על ידי היפוך לאחור כאשר הם נתקלים במכשול אוסמוטי (4M פרוקטוז). NLG-1 (ok259 ו tm474) X מוטציות מצליחים לזהות את המחסום הזה. מוטנטים פעמיים חסר NLG-1 ו nrx-1, זנים CRR21 (ok1649; ok259) VX ו CRR23 (tm1961; ok259) VX התאוששה את הפנוטיפ סוג בר. * מציין הבדל מובהק (P ≤ .001) על ידי מבחן t-סטודנט, בתגובה של כל זן של N2 בריסטול wild-type על ידי מבחן t-סטודנט

איור 2. ניסויים עם תולעים מציאה על ידי האכלה RNAi.
E.coli HT115 (DE3) הפך עם וקטור pL4440 ריק או המכיל שבר המתאים הגנים היעד nrx-1-1 או NLG שימשו נמאס תולעת זנים שונים. * מציין הבדל מובהק (P ≤ .001) על ידי מבחן t-סטודנט, בתגובה של המתח N2 נמאס עם חיידקים שנשאו את וקטור pL4440 עם שבר מיקוד הגן NLG-1 בהשוואה לזן N2 נמאס עם וקטור pL4440 ריק .

Discussion

Neurexins ו neuroligins לבצע תפקידים חיוניים הילוכים הסינפטי ¹¹ והבחנה של קשרים סינפטיים ^12. מולקולות הן זוהו גנים מועמדים לאוטיזם ^13,14.

בסרט זה אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של גנים המשפיעים על תגובת הימ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
זן	גן	אלל	מקור
בריסטול N2	-	-	aCGC
VC228	NLG-1	ok259	CGC
FX00474	NLG-1	tm474	bNBP יפן
VC1416	nrx-1	ok1649	CGC
FX1961	nrx-1	tm1961	NBP-יפן
NL2099	rrf-3	pk1436	CGC
CRR21	nrx-1; NLG-1	ok1649; ok259	זו עבודה
CRR22	nrx-1; NLG-1	tm1961; ok259	זו עבודה