A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
Neurexins ו neuroligins הם קרום תא עצב הידבקות חלבונים אשר מבצעים תפקידים חיוניים בידול הילוכים הסינפטי ו. Neuroligin מוטנטים לקוי של ג elegans פגומים באיתור כוח אוסמוטי, אך כאשר הם גם מכילים מוטציה בגן המקודד neurexin, הם לשחזר את הפנוטיפ סוג בר.
Neurexins ו neuroligins הם מולקולות הדבקה תא נוכח סינפסות מעוררות ו מעכבות, והם נדרשים לתפקוד נוירון לתקן רשת 1. חלבונים אלו נמצאים על ממברנות presynaptic ו postsynaptic 2. מחקרים בעכברים מעידים כי neurexins ו neurologins יש תפקיד חיוני בשידור סינפטי 1. דיווחים אחרונים הראו כי קשרים עצביים שינו במהלך הפיתוח של מערכת העצבים האנושית, להוות בסיס האטיולוגיה של מקרים רבים של ספקטרום האוטיזם 3.
Caenorhabditis elegans יכולה לשמש ככלי ניסיוני כדי להקל על לימוד של תפקוד של רכיבים סינפטיים, בגלל פשטותה ניסויים במעבדה, וכן בהתחשב בכך שמערכת העצבים שלו החיווט הסינפטי התאפיינה באופן מלא. ב-C. Elegans nrx-1 ו-1 NLG גנים orthologous כדי NRXN1 ו NLGN1 הגנים האנושיים המקודדים אלפא neurexin-1 ו-1 neuroligin חלבונים, בהתאמה. בבני אדם נמטודות, ארגון neurexins ו neuroligins דומה מבחינה לתחומים פונקציונליים.
ראש נמטודות מכיל את amphid, איבר חושי של נמטודות, אשר מתווכת לתגובות לגירויים שונים, כולל כוח אוסמוטי. Amphid עשוי 12 נוירונים דו קוטבית חושית עם דנדריטים ריסי אחד האקסון מסוף presynaptic 4. שניים מהם נוירונים, בשם ASHR ו ASHL חשובים במיוחד התפקוד החושי האוסמוטי, גילוי מסיסים במים דוחי עם כוח אוסמוטי גבוה 5. דנדריטים של שני נוירונים להאריך לקצה הפה האקסונים להאריך לזירה עצב, שם הם יוצרים קשרים סינפטיים עם נוירונים אחרים לקבוע את התגובה ההתנהגותית 6.
כדי להעריך את ההשלכות של neurexin ו neuroligin ב והימנעות גבוה כוח אוסמוטי, אנו מראים את התגובה שונים של C. elegans מוטנטים פגום nrx-1 ו-1 NLG גנים, באמצעות שיטה המבוססת על טבעת פרוקטוז 4M 7. פנוטיפים התנהגותיים אושרו באמצעות שיבוטים RNAi ספציפיות 8. ב ג elegans, dsRNA הנדרש להפעלת RNAi יכול להיות מנוהל על ידי האכלה 9. מסירת dsRNA דרך מזון גורם הפרעה RNAi של הגן של עניין ובכך מאפשר זיהוי של רכיבים גנטיים מסלולים הרשת.
1: assay הימנעות אוסמוטי.
2: הדור של תולעים מציאה על ידי האכלה RNAi.
3: מתחים בשימוש.
ג זנים elegans המשמשים בעבודה זו מוצגים בלוח 1. זנים Mutant היו מחוץ חצה נגד N2 בר - סוג לפחות ארבע פעמים להסיר מוטציות אקראיות רצויים שהיו יכולים שנוצר במהלך הפרוטוקול mutagenesis.
. OP50 E coli זן היה suppliied ידי Caenorhabditis גנטית מרכז, מאוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב E.coli HT115 (DE3) עם pL4440 פלסמיד שנשא nrx-1 (JA: C29A12.5). NLG ו-1 (JA: C40C9.5 ) שברי גן סופקו על ידי ד"ר פיטר Askjaer, Centro de Andaluz Biología דל Desarrollo (CABD), CSIC Universidad פבלו Olavide, סביליה, ספרד.
4: תוצאות נציג.
תוצאות להמחשה מיוצגים איורים 1 ו -2. עשר החיות של זן כל מינימום של שלושה ניסויים העתק בוצעו.
באיור 1. ניסויים של התנהגות ההימנעות האוסמוטי.
זנים בקרה nrx-1 (ok1649 ו tm1961) mutantworms V לקוי להגיב על ידי היפוך לאחור כאשר הם נתקלים במכשול אוסמוטי (4M פרוקטוז). NLG-1 (ok259 ו tm474) X מוטציות מצליחים לזהות את המחסום הזה. מוטנטים פעמיים חסר NLG-1 ו nrx-1, זנים CRR21 (ok1649; ok259) VX ו CRR23 (tm1961; ok259) VX התאוששה את הפנוטיפ סוג בר. * מציין הבדל מובהק (P ≤ .001) על ידי מבחן t-סטודנט, בתגובה של כל זן של N2 בריסטול wild-type על ידי מבחן t-סטודנט
איור 2. ניסויים עם תולעים מציאה על ידי האכלה RNAi.
E.coli HT115 (DE3) הפך עם וקטור pL4440 ריק או המכיל שבר המתאים הגנים היעד nrx-1-1 או NLG שימשו נמאס תולעת זנים שונים. * מציין הבדל מובהק (P ≤ .001) על ידי מבחן t-סטודנט, בתגובה של המתח N2 נמאס עם חיידקים שנשאו את וקטור pL4440 עם שבר מיקוד הגן NLG-1 בהשוואה לזן N2 נמאס עם וקטור pL4440 ריק .
Neurexins ו neuroligins לבצע תפקידים חיוניים הילוכים הסינפטי 11 והבחנה של קשרים סינפטיים 12. מולקולות הן זוהו גנים מועמדים לאוטיזם 13,14.
בסרט זה אנו מציגים שיטה פשוטה המאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של גנים המשפיעים על תגובת הימ?...
ברצוננו תודה ד"ר אנטוניו מירנדה-Vizuete לעזרה יקר שלו. כמו כן, אנו רוצים להביע את הכרת התודה שלנו סלמה Boulayoune ואיזבל Caballero לקבלת סיוע טכני רב ערך. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם Junta de אנדלוסיה (BIO-272). מחקר זה בוצע בהסכמה עם החוקים השולטים כיום ניסויים גנטיים באירופה.
1. לוח ג elegans זנים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
זן | גן | אלל | מקור |
בריסטול N2 | - | - | aCGC |
VC228 | NLG-1 | ok259 | CGC |
FX00474 | NLG-1 | tm474 | bNBP יפן |
VC1416 | nrx-1 | ok1649 | CGC |
FX1961 | nrx-1 | tm1961 | NBP-יפן |
NL2099 | rrf-3 | pk1436 | CGC |
CRR21 | nrx-1; NLG-1 | ok1649; ok259 | זו עבודה |
CRR22 | nrx-1; NLG-1 | tm1961; ok259 | זו עבודה |
א Caenorhabditis גנטית מרכז, מאוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב.
ב הפרויקט הלאומי Bioresource עבור הניסויי בבעלי חיים "נמטודות סי אלגנס". טוקיו נשים הרפואי האוניברסיטאי, יפן.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved