רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Summary

כאן אנחנו מראים איך לעשות רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר.

Abstract

טיפול תרופתי של בעלי חיים שלמים היא כלי חיוני בכל מערכת מודל מחקרים גנטיים תרופתי כימי. תוך ורידי (IV) הזרקה היא לעתים קרובות בצורה היעילה ביותר פולשנית המסירה של סוכן של עניין. בשנת דג הזברה (

Protocol

חלק 1. הכנת חומר הזרקה

1. Tg (גלובין: GFP) בתאים:
2. Bleed דגים התורם מבוגר באמצעות קצה פיפטה 10ul מצופה הפרין (1unit/ul) לדגים לנקב מאחורי הזימים.
3. לשאוב כדוריות דם אדומות לוותר במאגר תא (PBS 0.9X + 5% FBS + פן 1% / סטרפטוקוקוס).
4. תא ההשעיה סנן על רשת 40uM ולקבוע ריכוז של תאים באמצעות hemocytometer כפי שתואר לעיל על ידי LeBlanc et al.
5. ספין למטה resuspend במאגר תא בריכוז הרצוי כזה נפח הזריקה האחרונה היא לא יותר מאשר 5ul. כאן אנו מזריקים תאים 1.5-2000000 / נמען.
6. עבור, dextran טקסס האדום ®, לפזר את הצבע DPBS ריכוז זריקת הסופי של 10-12 מ"ג / מ"ל. תוכנית להזרים 4 UL לכל הדגים.

חלק 2. הזרקה

1. הרדימי דגים tricaine (4.2ml (4mg/ml) מים tricaine/100ml דגים).
2. לשטוף המילטון מזרק 3-4 פעמים לפני הזריקה באמצעות אתנול 70%. יש לשטוף 3-4 פעמים עם DPBS 0.9X.
3. מקום דגים בצד הגבי מעלה מול ימין על ספוג לח.
4. החזק את המזרק המילטון עם יד ימין שלך עם האצבע המורה על הבוכנה. בעדינות לייצב את הגוף של הדג ביד שמאל.
5. מקמו את המחט עם שפוע פונה כלפי מעלה כך שאם העין של הדג היו שעון, המחט תהיה הצבעה במיקום 7:00 ו בזווית של 45 מעלות דגים (איור 1).
6. הכנס בעדינות מחט 1-2 מ"מ למצב 7:00 ולאט לאט לוחץ על המתג.
7. אפשר לשחזר את הדגים במים E3 טריים.
8. לשטוף מחט, כמתואר לעיל, בין זריקות של חומרים כימיים שונים.
9. תא Flick פתרון resuspend התאים כל כמה דקות כדי למנוע clumping התא.
10. שמור על הדגים את זרימת שבוע 1 עם שינויים מים בכל יום, כדי למנוע זיהום. אנחנו שומרים דג במים לטיפול נמרץ למשך תקופה זו (מעיל 10ml מתח + pemafix 5 מ"ל + melafix 5 מ"ל לכל 38 ליטר מים E3).

חלק 3. נציג תוצאות

כאשר ביצעו כראוי, אפשר לדמיין החומר מוזרק אם זה כבר מסומן בדרך כלשהי. לדוגמה, Tg (גלובין: GFP) כדוריות הדם האדומות יש לראות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה במחזור vasculature של דגים קספר הנמען זמן קצר לאחר ההזרקה כפי שמוצג באיור 2. כמו כן, הזרקת dextran 70kDa, מצומדות לטקסס האדום ® ניתן דמיינו vasculature של דג שקוף מיד לאחר ההזרקה רטרו מסלולית (איור 3). תאים כליה מן פלורסנט (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם יכול גם להיות מוזרק רטרו orbitally לתוך הדג קספר מוקרן הנמען. תאים אלה בסופו של דבר הביתה מח הנמען (תמונה 4 א) והוא רשאי מכן להמשיך לאכלס מחדש את כליה לאחר מספר שבועות (איור 4 ב).

אם הזריקה הוא רדוד מדי או את הזווית של המחט עוקף את רטרו מסלולית סינוס חלל ורידי, החומר המוזרק עלול להיות דמיינו מתאגדים סביב העין או זורם החוצה. לחילופין, אם הזריקה הוא עמוק מדי, דגים עשויים לחוות נזק לרקמות או דימום מוגזם, למרות שהם עדיין יכולים להתאושש. כאשר ביצעו כראוי, התמותה לאחר ההזרקה רטרו מסלולית צריך להיות פחות מ 5% דגים מוזרק הכולל ההצלחה של משלוח הדם צריך להיות גדול מ 90% של דגים מוזרק מוחלט.

איור 1: איור של טכניקה רטרו מסלולית ההזרקה. העין הימנית של הדג מיוצג שעון אנלוגי שבו עמדה 7:00 המתאים במקום הזרקה נכונה.

איור 2: Tg (גלובין: GFP) כדוריות הדם האדומות במחזור vasculature הזנב של דג קספר מבוגר שלושה ימים לאחר ההזרקה רטרו מסלולית.

איור 3: זריקה מוצלחת של dextran 70kDa מצומדות לטקסס האדום ® משמש לצבוע מייצרת vasculature ניאון הדגים הבוגרים שקוף, קספר והוא מוצג בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תקן שלם של בעלי חיים.

תרשים 4 א: שלושה ימים לאחר הזרקת רטרו ההקפה של כל התאים במח כליה מן (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם, התאים ניתן דמיינו ביות עד לשד הכליה של קספר מוקרן דגים בוגרים הנמען.

דמות4b: ארבעה שבועות לאחר ההזרקה רטרו ההקפה של כל התאים במח כליה מן (β-אקטין: GFP) Tg דגים התורם, ואכלוס של הכליה הנמען ירוק עם כל תורם כליה תאים במח ניתן דמיינו ב קספר מוקרן דגים בוגרים הנמען.

Discussion

רטרו מסלולית הזרקת דג הזברה מבוגר נותן את היעילות הגבוהה ביותר של מסירת החומר מוזרק לזרם הדם עם השכיחות הנמוכה ביותר של תמותה. בשל אופיו של המקום הזרקה, לנקב מופיע לרפא במהירות, להקטין את המופע של זיהום כמות איבוד הדם. האתר עשוי אפילו להיות מוזרק שוב ושוב במהלך פרק זמן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	2106	Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S	Western Chemical		MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Dextran, Texas Red®	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
E3			5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe	Hamilton Co	80300	701N 10uL SYR (26s/2”/2)