מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

Summary

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת טיפול ארבידופסיס thaliana השתילים לפני מיון התא.

Abstract

ברזולוציה גבוהה, סוג ספציפי תא ניתוח של ביטוי גנים משפר באופן משמעותי את ההבנה של תקנה התפתחותית ולתגובות לגירויים סביבתיים באורגניזם כלשהו תאיים. ההכלאה ב באתרו גן להדמיה עיתונאי יכול במידה מוגבלת לשמש למטרה זו אבל ברזולוציה גבוהה כמותי RT-PCR או תפוקה גבוהה transcriptome רחב ניתוח הבידוד של RNA מתוך סוגי תאים מסוים הנדרש. נייד ניתוק של רקמת להביע סמן חלבון פלואורסצנטי בסוג תאים ספציפיים ומיון הבאים פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) מאפשרת לאסוף כמות מספקת של חומר להפקת RNA, cDNA ניתוח סינתזה / הגברה microarray.

סט נרחב של סוג ספציפי שורות תאים כתב ניאון זמין לקהילה מחקר הצמח. במקרה זה, שתי שורות סמן השורש thaliana ארבידופסיס משמשים: P _SCR: GFP (endodermis מרכז שקט) ו-P _WOX5: GFP (מרכז שקט). מספר רב (אלפים) של השתילים גדלים hydroponically או על צלחות אגר וקצרו להשיג חומר שורש מספיק לניתוח נוסף. נייד ניתוק של חומר צמחי מושגת על ידי עיכול אנזימטי של התא הקיר. הליך זה עושה שימוש plasmolysis osmolarity-Induced גבוה cellulases זמינים מסחרית, pectinases ו hemicellulases לשחרר protoplasts לתוך פתרון.

FACS-GFP חיובי תאים עושה שימוש להדמיה של ירוק לעומת ספקטרום פליטה אדום של protoplasts נרגש לייזר 488 ננומטר. GFP חיובי protoplasts ניתן להבחין ביחס מוגברת שלהם ירוק פליטה אדום. Protoplasts ממוינות בדרך כלל ישירות לתוך חוצץ מיצוי RNA ומאוחסנים לעיבוד נוסף במועד מאוחר יותר.

טכניקה זו מתגלה להיות פשוטה מבחינה מעשית. יתר על כן, הוא הראה כי ניתן להשתמש בו ללא קושי לבודד בכמות מספקת של תאים עבור ניתוח transcriptome, אפילו סוגי תאים נדירים מאוד (למשל תאים מרכז שקט). לבסוף, תוכנית ההתקנה של צמיחה עבור שתילים ארבידופסיס הוא הוכיח המאפשרת טיפול לא מסובך הצמחים לפני מיון התא (לדוגמא עבור סוג ספציפי של התא ניתוח של תגובות דחק ביוטי או אביוטי). משלים פוטנציאל לשימושים FACS של protoplasts צמח הם דנו.

Protocol

1) הכנת חומר המפעל

1. Protoplasts ניתן להסיק הרבה מיני צמחים ורקמות שונים ובלבד התמהיל הנכון של אנזימי עיכול דופן התא משמש ^1. לפני ניסוי בקנה מידה מלא נעשית, עיכול בקנה מידה קטן של החומר מומלץ על מנת להעריך את היעילות protoplasting של הרקמה, אנזימים, וכו ', כדי לאמוד את אחוז התאים החיוביים למיון התא. כאן, protoplasts נגזר שורשי שתילי thaliana ארבידופסיס כי תא מסוג במיוחד לבטא חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP) משמשים. Endodermis מרכז שקט מסומנים על ידי P _SCR: GFP ומרכז שוקט על ידי P _WOX5: GFP ^2,3 (איור 1).
2. שתילים בוגרים hydroponically ב phytatrays (סיגמא; איור 2 א) על מסנן ניילון (250 מיקרומטר רשת; NITEX) המאפשרת השורשים לצמוח דרך לתוך מדיום הגידול (0.22% w / v Murashige ובינוניים Skoog בסל [סיגמא], 1% w / v סוכרוז, 0.05% w / v MES [2 - (N-morpholino) חומצה ethanesulfonic], pH 5.7 עם KOH). לחלופין, ניתן לגדל צמחים על גבי מסנן ניילון (100 מיקרומטר רשת) ב במאונך צלחות אגר 1% (איור 2b).
3. השימוש במסננים הנ"ל לא רק מסייע הקציר של השורשים, הוא גם מאפשר טיפול נוסף קל של שתילים, אם תרצה בכך. המסננים מאפשרים את השתילים שיועברו בהמוניהם phytatrays חדש או צלחות אגר השלים עם זרז של עניין. כך, למשל, להגדיר את phytatray למעלה נעשה שימוש לצורך ניתוח התא סוג ספציפי של התגובה תעתיק לטיפול חנקן שתילים ארבידופסיס ^4.
4. ודאו כי סמן פלורסנט מיקרוסקופית שלך באה לידי ביטוי בצורה נכונה (במיוחד בעת שימוש באפשרות הטיפול, כמו סוג התא הסמנים הספציפיים עצמם עשויים להיות מושפעים הטיפול). במקרה זה, שתילים נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, איור 1). שימו לב לסוג ספציפי שורות תאים פלורסנט סמן צריכה להיות מאופיינת בתחילה תחת מיקרוסקופ confocal כדי לקבוע בדיוק אילו סוגי תאים מסומנים ולקבוע השתנות בביטוי.

2) הכנת התמיסה protoplasting

1. ממיסים 1.25 w / v% cellulase (Yakult), 0.3% w / v Macerozyme (Yakult), 0.4 מ 'ד מניטול, 20 מ"מ ו - MES KCl 20 מ"מ (ממלאי M 1) במים demineralized ולהתאים את ה-pH ל 5.7 עם 1 מ טריס / HCl pH 7.5. פתרון זה יהיה עכור מעט.
2. מחממים את הפתרון 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (הפתרון יהפוך ברור) ולתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני הוספת 0.1% w / v BSA (אלבומין בסרום שור), 10 mM CaCl _2, ו - 5 מ"מ β-mercaptoethanol .

3) קציר protoplasting החומר צמח

1. שורשי נקצרים על ידי גירוד להם את רשת ניילון עם אזמל והפקידו לתוך בקבוקון המכיל את הפתרון protoplasting. באופן כללי, 10 מ"ל של תמיסת protoplasting משמש לכל 1,500 שורשי שתיל.
2. נער את צלוחיות בעדינות (75 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. זמן הדגירה כבר עשוי להגדיל את התשואה protoplast אלא גם להוסיף אפקט של protoplasting עצמו על ביטוי גנים.
3. סנן הפתרון protoplast עם מסננת תא 40 מיקרומטר (BD פלקון) ולחלק את הפתרון מעל חרוטי 15 צינורות מ"ל (BD פלקון).
4. ספין צינורות בצנטריפוגה הנדנדה דלי במשך 10 דקות ב הערה ג 500 זה מהירות צנטריפוגה יהיה תלוי בסוג של protoplasts בשימוש, השבריריות שלהם ואת כמות פסולת התא הנוצר במהלך הטיפול האנזימטית.
5. הסר את רוב supernatant, resuspend protoplasts בפתרון הנותרים ולבדוק אותם מיקרוסקופית (איור 3).
6. לעשות שימוש hemacytometer להעריך את מספר וצפיפות protoplasts. צפיפות התאים תקבע הזרקה מדגם מהירות, קצב האירועים לכל השני ולכן סך כל הזמן הדרוש כדי למיין את התאים ב FACS (ראה גם סעיף 4.3).
7. 3.7) או להמשיך ישירות FACS או לרחוץ resuspend protoplasts בפתרון דגירה, כגון W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, KCl 5 מ"מ, 5 מ"מ MES, להתאים את pH עד 5.7 עם KOH) או פתרון protoplasting ללא הוסיף אנזימים. במיוחד כאשר מסתכלים שינויים תעתיק, יש חשיבות כדי למזער את החשיפה של הדגימות בתנאים שעשויים להשפיע על ביטוי גנים, כגון שינוי למאגר protoplasts נשמרים פנימה לכן מומלץ לשמור על protoplasts בפתרון protoplasting והמשך כדי FACS בהקדם האפשרי.

4) מיון פלואורסצנטי תא פעיל של protoplasts

1. הפעל ולהכין את סדרן התא. כאן, FACSAria (BD) משמש.
2. הגדרת זרם לזרום עם 100 & mu; זרבובית מ 'לחץ נדן 20 psi.
3. צפיפות התאים הזרקת מהירות מדגם ניתן להתאים את הניסוי מסוים בהתבסס על אם התשואה הטובה ביותר האפשרית או מהירות השגה המהיר ביותר הוא הרצוי. יש לנו מיון בהצלחה עם צפיפות של עד 10,000,000 תאים / מ"ל.
4. השתמש תסיסה מדגם אפשרות FACS כדי למנוע שקיעה של protoplasts. אם סתימת של FACS היא בעיה, ישנם שלושה שלבים לפתרון בעיות אפשריות: 1. בצע backflush מדגם-line. 2. מדולל ההשעיה protoplast שלך כדי להפחית את הצפיפות. 3. לנקות את הפתרון protoplast על ידי חזרה על השלב סינון (3.3) לאחר צנטריפוגה ו resuspension.
5. הכן את מכשיר למדידת פיזור קדימה (FSC), לצד פיזור (SSC) ופליטה ב 530/30 ננומטר עבור ה-GFP ו ננומטר 610/20 אדום עבור ספקטרום autofluorescence (RSA) לאחר עירור על ידי לייזר 488 ננומטר. אלה הם למעשה רק את הפרמטרים המשמשים לבודד GFP חיובי protoplasts. הנה, את הגדרות המתח היו כדלקמן: FSC - 60V, SSC 250V, 350V ו-GFP RSA 335V. שים לב כי הגדרות מתח אופטימלי יהיה שונה עבור כל FACS ויהיה גם צורך להתאים את אורך החיים של סדרן התא.
6. התחל על ידי הגדרת dotplot עבור פיזור קדימה לעומת פיזור לוואי. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים הנמדדים הם התרכזו בעלילה.
7. בשלב הבא, ליצור עלילה נקודה של אותות פלואורסצנטי ירוק לעומת אדום. להחיל את ההגדרות כך מתח את האירועים נמדדת התשואה אוכלוסייה אלכסוני מרוכז בעלילה כאשר מסתכלים השעיה (לא GFP) wild-type protoplast. ההשעיה protoplast נגזר משורת סמן GFP יפיק האוכלוסייה ברורה של אירועים פלואורסצנטי ירוק לעולם לא לראות wild-type דגימות.
8. הגדרת אילוצים פיצויים להתאים חפיפה בין ספקטרום ה-GFP ו-RSA. פרופר אילוץ הגדרות הפיצוי יאפשר הפרדה טובה יותר של ה-GFP חיובי protoplasts מ protoplasts הלא GFP ופסולת. האילוצים משמש כאן הן כדלקמן: RSA, GFP מינוס 17.91%.
9. הגדרת שער לזהות GFP חיובי אירועים, שליטה שלילי של אי - GFP protoplasts צריך לשמש כדי לסייע בהגדרת גבולות השער (איור 4).
10. יישום הפסקת פיזור קדימה כדי להשאיר פסולת קטן מתוך ניתוח. דמיינו את ה-GFP חיובי אירועי העלילה מול SSC FSC כדי לקבוע את המיקום של הפסקת. הנה, הפסקת נקבע 5000. שים לב FACS יהיה לספור פסולת כאירועים למיין מדגם עם רמות גבוהות של פסולת ייתכן GFP שונה אחוזים אירועים חיוביים מהצפוי. זה לא בהכרח בעיה. עם זאת, פסולת יותר במדגם, ככל למיין את ייקח.
11. בהתאם הניסוי ואת שפע של סוג התא כדי להיות מנותח, להגדיר את מצב דיוק FACS או עבור תשואה אופטימלית או טוהר אופטימלי של תאים ממוינים.
12. להפקת RNA, להכין אוסף צינורות (1.5 מ"ל צינורות microfuge) עם כמות מתאימה של חיץ מיצוי RNA. עם ההגדרה הזו, 20,000 אירועים מיון תניב בנפח כולל של כ 100 μl אשר מוינו ל 350 μl של חיץ החילוץ (RNeasy מיקרו בערכה, QIAGEN). מערבבים דגימות לאחר השלמת מהסוג כמו השעיה התא יכול בריכה בראש.
13. חנות דגימות או להמשיך ישירות RNA החילוץ. מנתח microarray מוצלח כבר preformed עם RNA המופק קטנה כמו 500 אירועים מיון. הנה, השתמשנו ערכת חילוץ RNeasy מיקרו (QIAGEN), את WT-Ovation פיקו RNA מערכת הגברה ו FL-Ovation cDNA ביוטין Module V2 (NuGEN).

נציג תוצאות

אחת phytatray של כ -1,500 אחד בן שבוע P _SCR: שתילים GFP הניבו כ -60,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 2.6% מכלל 65,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ב).

שמונה צלחות של כ 1500 ארבעה ימים בת P _WOX5:: כל השתילים GFP (12,000 סה"כ) הניבה כ - 30,000,000 protoplasts (כפי שנמדד על ידי hemacytometer). 0.063% של 16,000,000 אירועים FACS-מעובד הוגדרו GFP להיות חיובי מוינו (איור 4 ג').

10,000 אירועי מיון משמשים בדרך כלל עבור מיצוי רנ"א יכול להניב 20-140 ng סך רנ"א (איור 5).

באיור 1. סוג ספציפי Cell-GFP סמן שורות שורש ארבידופסיס. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ו-GFP לסנן על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. שתי שורות סמן השתמשו בניסוי הזה חזותי מוצגים;א) P _SCR: GFP ו-B) P _WOX5: ה-GFP.

איור 2. שתילים הצמח תנאי הגידול. גדלו בקר סביבתי hydroponically phytatrays ב (א) או על צלחות אגר במאונך (ב).

איור 3. Protoplasts הצמח להביע GFP. מיקרוסקופ פלואורסצנטי התמונות צולמו עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) ומסנן GFP על מיקרוסקופ Eclipse 90i (Nikon) פועל על Metamorph תוכנה (התקנים מולקולריים). התמונות DIC ו-GFP היו מעולף למטרות ויזואליזציה. החצים מצביעים על תא פרץ, פסולת תאים protoplast GFP חיובי. המרחק בין שני קווים לבנים הוא 50 מיקרומטר.

איור 4. מיון פלואורסצנטי תא פעיל של ה-GFP חיובי protoplasts Protoplasts נגזר סוג בר (א) _SCR P:.: GFP (ב) או P _WOX5: GFP (ג) קווי סמן נותחו מיון עם FACSAria (BD) מוגדר באמצעות שערים על dotplot של ירוק (530 / 30 ננומטר; ציר x) לעומת אדום (610 / 20 ננומטר; ציר Y) פלואורסצנטי. 100.000 אירועים מוצגים כל חלקה. האירועים נופלים בתוך השער מיון GFP מודגשים בירוק.

איור 5. נציג RNA עקירות מ 10.000 תאים ממוינים. תאים מוינו ישירות RNA מיצוי חיץ (QIAGEN), RNA היה מטוהרים ובדק על טוהר ריכוז, שלמות על 2100 Bioanalyzer (Agilent). שלושה משכפל לשני קווי סמן מוצגים.

Discussion

Protoplasts יכול, באופן עקרוני, להיגזר במגוון של רקמות הצמח, אופטימיזציה תנאים נוחים יהיה מאוד לשפר את איכות וכמות RNA. הן פתרון protoplasting ואת חיץ הדגירה בחירה בשימוש ישפיעו על היבט זה.

רבים חלבוני ניאון שונים יכול לשמש, בהתאם ליכולות של FACS ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-250/50
100 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-100/47
Square petri dishes	Fisher Scientific	08-757-10k
Phytatrays	Sigma-Aldrich	P1552
Murashige and Skoog Basal Medium (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
sucrose	Fisher Scientific	S5-3
MES	Sigma-Aldrich	M2933
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	10 M stock
Eclipse 90i microscope	Nikon Instruments
Cellulase R-10	Yakult Pharmaceutical
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9546
KCl	Sigma-Aldrich	P8041	1 M stock
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
β-mercapt–thanol	Calbiochem	444203
CaCl2	Sigma-Aldrich	C2536	1 M stock
orbital shaker	Labline Instruments
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
conical 15 ml tubes	BD Biosciences	352196
table centrifuge	Sorvall, Thermo Scientific	Legend RT
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
FACSAria	BD Biosciences
1.5 ml microfuge tubes	VWR international	20170-38
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
WT-Ovation Pico RNA Amplification System	NuGEN	3300_12
FL-Ovation cDNA Biotin Module V2	NuGEN	4200_12