דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Summary

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

Abstract

המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (> 10

Protocol

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B (mCD40B) מ splenocytes מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד Murine (CD40L) להביע תאים הלה (tmuCD40L הלה), אשר ישמש צלחת מחויב תאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל Murine CD40-B.

א הכנת תאים מזין (tmuCD40L הלה)

הלה tmuCD40L הוא קו חסיד האנושי תא אפיתל, אשר מעולם לא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ.

1. הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה.
2. הוסף 4 מ"ל של 1x טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ ² במשך 10-15 דקות על 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים.
3. הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות להפסיק עיכול עם טריפסין.
4. מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות.
5. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים:
   1. 2.5 x 10 ⁶ תאים תת
   2. 0.4 x 10 ⁶ תאים / היטב הקרנה המשמש בתרבות CD40-B Murine תא
   3. שאר להקפיא (במידת הצורך).
6. ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות.
7. הסר את supernatant.
   1. עבור subculturing: resuspend 2.5 x 10 ⁶ תאים בינוניים 10 מ"ל הבחירה 75 ס"מ ² בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 2.5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל) ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO _2. פיצול התאים פעמיים בשבוע.
   2. עבור התרבות CD40-B Murine התא: אתה צריך 2.4 x 10 ⁶ תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים tmuCD40L הלה בינוני סוג בר בצפיפות של 0.2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO _2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tmuCD40L תאים הלה הם חסיד (לפחות 4 שעות: לבדוק הדבקות באמצעות מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב)

ב Murine CD40-B תרבית תאים

I. הכנת splenocytes לגירוי-CD40 (יום 0):

שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טרי מיד interleukin-4, ו - β-Mercaptoethanol ציקלוספורין למדיום הגידול Murine לפני השימוש.

1. לנתח טחול של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) ולשטוף אותו פעמיים 10-20 מ"ל DMEM בתוספת Gentamycin [15μg/mL] על ידי העברת אותה עם טיפ 10 מ"ל פיפטה משפופרת אחת לאחרת. הימנע העברת מזהמים (למשל שיער) של העכבר. בשר טחון הטחול על ידי העברת אותו דרך מסננת תא (100μm) ולשטוף מסננת עם עוד 10 מ"ל של מדיום. ספין למטה splenocytes ב XG 265 7 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend אותם 7ml muCD40-B בינוני התא לימפוציטים נפרד על ידי צנטריפוגה צפיפות Ficoll. לשם כך התאים בשכבה על 5 מ"ל עכבר Pancoll (שחומם מראש בטמפרטורת החדר) בתוך שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 450 למשך 30 דקות ללא הבלם בטמפרטורת החדר.
2. צייר את רוב השכבה העליונה, ומשאיר את השכבה הלימפוציטים באין מפריע על הממשק. העברת שכבת הלימפוציטים לצינור 50 מ"ל טרי, לשטוף פעם עם DMEM 30 מ"ל עם Gentamycin [15μg/mL] על ידי ספינינג למטה XG 265 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום mCD40 B-הכביסה. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא. קביעת מספר תאים על ידי ספירת aliquot ההשעיה התא.
3. ספין למטה את הכמות הנדרשת של התאים ב XG 265 במשך 7 דקות. עבור צלחת 6-באר 5 x 10 ⁶ תאים / גם יש צורך, ובכך 30 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת.
4. הסר את supernatant ו resuspend לימפוציטים ב 1.25 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום mCD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 1 U / mL של interleukin-4 כגורם גדילה, 100 מיקרומטר β-Mercaptoethanol ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תולדה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!).
5. הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L הלה.
6. בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה הלימפוציטים (1.25 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
7. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO _2.
8. ביום 3 reculture התאים (המשך II.1.).

השנייה. תת של תאים mCD40B (יום 3 ולאחר מכן פעמיים בשבוע):

1. קציר mCD40B תא מצרר על ידי pipetting במרץ מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל.
2. ספין למטה XG 265 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום mCD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. Resuspend mCD40B תאים בינוניים mCD40 B-תרבות בריכוז של 0.75 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
3. הוספת פתרונות טרי Murine interleukin-4 בריכוז של 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol-β מיקרומטר ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ​​ציקלוספורין למדיום.
4. הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L מוקרן הלה.
5. בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה תא mCD40B (0.75 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
6. דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO _2.
7. שוב תת התאים כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים Murine B לאחר סך של 14 ימים.

ג בעיות הירי: מה אם CD40-B תאים לא גדלים?

1. בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין?
2. האם הצלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי מבוגר 24 שעות?
3. האם יש זיהום עם mycoplasma?
4. האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי עשה את זה יש את הפעילות הביולוגית המתאים?
5. האם β-Mercaptoethanol ו ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון?

איור 1a.

איור 1b.

איור 1d.

איור 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
תא מזין בינוני סוג בר	תא מזין מבחר בינוני
מגיב	ריכוז	מגיב	ריכוז
RPMI 1640		RPMI 1640
L-גלוטמין	300 מיקרוגרם / מ"ל	L-גלוטמין	300 מיקרוגרם / מ"ל
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל	Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל
		Hygromycin B	0.2 מ"ג / מ"ל

mCD40-B בינוני כביסה	mCD40-B בינוני תרבות
מגיב	ריכוז	מגיב	ריכוז
D-ממ		D-ממ
L-גלוטמין	580 מיקרוגרם / מ"ל	L-גלוטמין	580 מיקרוגרם / מ"ל
גלוקוז	4.5 מ"ג / מ"ל	גלוקוז	4.5 מ"ג / מ"ל
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל	Gentamycin	15 מיקרוגרם / מ"ל
		מ	0.1mm (1x)
		FBS	10%

מגיב	חברה	אין סדר
RPMI 1640	Invitrogen Gibco	REF 21875
D-ממ	Invitrogen Gibco	REF 41965
Dulbeccos PBS (10x)	PAA	חתול לא H15-011
Gencin	דלתא בחר	לאמנות אין 7395800
FBS	Lonza	חתול לא DE14-802C
HEPES הצפת	PAA	חתול לא S11-001
ממ NEAA	Invitrogen Gibco	REF 11140
Hygromycin B	PAA	חתול לא P02-015
רקומביננטי Murine אינטרלויקין 4	Immunotools	חתול לא 12340045
ציקלוספורין	נוברטיס	חתול לא 0078-0109-01 NDC
טריפסין / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco	REF 15400-054

מגיב	חברה	אין סדר
סטרילי פיפטה טיפים	Sarstedt
6 גם צלחת	NUNC	חתול לא 140675
50 מ"ל צינור חרוטי	BD פלקון ™	חתול לא 352070
תרבות רקמות צפחת	Sarstedt	חתול לא 83.1813.002