Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Summary

סרט הווידאו הזה מדגים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. נוירונים commissural ניתק מועילים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון והדרכה.

Abstract

נוירונים Commissural היה בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים הדרכה האקסון במהלך ההתפתחות העוברית חוט השדרה. גופי התא של הנוירונים האלה נמצאים בעמוד השדרה הגבי ו האקסונים שלהם לעקוב אחר מסלולי סטריאוטיפית במהלך ההתפתחות העוברית. אקסונים Commissural בתחילה הפרויקט ventrally כלפי floorplate. לאחר חציית קו האמצע, אקסונים אלה להפוך anteriorly הפרויקט לכיוון המוח. כל אחד משלבים אלה מוסדר על ידי פעולה של אותות הדרכה מספר. תרבויות מועשר בנוירונים commissural מתאימות בצורה אידיאלית עבור ניסויים רבים בהתמודדות עם מנגנוני pathfinding האקסון, כולל מבחני מפנה, immunochemistry וביוכימיה. כאן אנו מתארים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. ראשית, חוט השדרה מופרד רצועות הגב הם גזור החוצה. הרקמה הגב אז הוא ניתק את ההשעיה על ידי תא trypsinization והפרעה מכאנית. נוירונים הם מצופה על פולי-L-ליזין coverslips מצופים זכוכית או רקמות תרבות הכלים. לאחר 30 שעות

Protocol

1. Dissection של חוט השדרה הגבי עוברי חולדה

המלצות כלליות

שמור L-15 בינוני על הקרח ולעתים קרובות לשנות את המדיום בצלחת לנתיחה כדי לשמור על העוברים מגניב. זה עוזר לשמור על שלמות רקמות. כל השלבים מתבצעים עם שני זוגות מלקחיים דומון # 5 אלא אם צוין. כדי למנוע זיהום, לרסס את כל הכלים ומשטחי העבודה עם אתנול 70% ולשמור בינוני לנתיחה בקבוק סגור. כדי להעביר עוברים בין הכלים, השתמש פלסטיק לחתוך טפטפת או כף מחוררת. זה קריטי לא לפגוע בעמוד השדרה (שסחב, מתיחות) כדי להשלים בהצלחה את הניתוח.

הכנה

• הקרה L-15 בינוני
• 50 מ"ל של L-15 + חום מומת 10% סוס בסרום (HiHS). שמור על הקרח.

חוט השדרה לנתיחה

1. להרדים E13 להריון מבוים חולדה (E0 = היום הראשון לאחר יום הזדווגות) עם תא ה-CO ₂ לפי הנחיות מוסדיים.
2. תרסיס אתנול 70% על הבטן. קורט למשוך את העור באזור הבטן התחתונה עם מלקחיים לגזור במספריים כירורגית. חזור לחתוך שריר שכבות הצפק להגיע אל חלל הבטן. יצירת חתך V-צורה על ידי חיתוך הרקמה בצדי הבטן, עד החזה. הרם ולמשוך בחזרה את הרקמה לחשוף את חלל הבטן.
3. הרחם קשורה בשלושה מוקדים: בבית הבטן במרכז התחתון, בשני קצוות לרוחב העליון. הרם את הרחם על ידי גרירה על רקמת בין שקי עובריים. חותכים את רקמת החיבור כדי להסיר את הרחם ומניחים בצלחת פטרי מלא L-15 על הקרח.
4. השלבים הבאים נעשים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. כדי להפריד עובר מרקמות extraembryonic וממברנות עובריים, לתפוס את הרקמה בין שקי הרחם עם זוג אחד של מלקחיים,. עם זוג אחר, לצבוט את הצד שקוף יותר שק לחתוך את הקרומים שטחית (את הצד האפל הוא השליה). לסחוט בעדינות את העובר על ידי לחיצה על הצד השליה של שק. הסר את כל העוברים ומניחים בצלחת פטרי מלא L-15 על הקרח.
5. מקום אחד העובר בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ מלאים קר כקרח L-15. שימוש microscissors, לחתוך את הראש ואת החלקים האחוריים בזוויות שמוצג באיור 1 א.
   
   חיתוך בזוויות אלה יסייעו למצב העובר כאשר הניח "פנים הגחון למטה".
   
   
6. העובר מיקום "פנים הגחון למטה" (anterior הצבעה משם האחורי והצביע לעבר הנסיין) (איור 1b).
7. להחזיק היטב את העובר מצד אחד, באמצעות מלקחיים כדי "להצמיד" את העובר (איור 1 ג'). אל תזיז את מלקחיים, כפי שהוא יקרע את הרקמה. עם זוג השני של מלקחיים, לפשוט את העור המכסה האחורי של העובר החל האזור בין מלקחיים "החזקה" (תאנה 1d-e). זה יחשוף את חוט השדרה, אשר בשלב זה, הוא עטוף על ידי ממברנות (קרומי המוח).
   
   תפוס את העור מן הצדדים ולא מעל חוט השדרה, כדי למנוע שסחב את חוט השדרה.
   
   
8. חלקית לנתק את הרקמה לצד הימני של חוט השדרה (איור 1f). החל ברמה של מלקחיים מחזיק, לתקוע את הרקמה עם מלקחיים סגור, קרוב ככל האפשר אל חוט השדרה. ואז, לאט לאט לפתוח את מלקחיים לקרוע את הרקמה. זה צריך לנתק את הגרעינים השורש הגבי (DRGs) מתוך חוט השדרה, ויש גם לשבש איברים הגחון. השאירו כמה רקמות מצורף בקצוות הקדמי ואת האחורי. רקמות השארת המצורף מוסיף משקל העובר, ובכך למנוע ממנו נמשכת כלפי מעלה במהלך לשלב הבא. בנוסף, רקמות המשמש לשמור על העובר בשלבים מאוחר יותר.
9. החל מסוף הקדמי, השתמש את המחט בצורת וו טונגסטן לחתוך את קרומי המוח, לפתוח את עמוד השדרה לאורך roofplate (איור 1g).
10. סובב את העובר 180 מעלות (posterior מצביע משם, מצביע הקדמי לקראת הניסוי) (איור 1h).
    
    זה מאפשר הנסיין להשתמש ביד אותו לנתק את הרקמה מהצד השני של העובר.
    
    
11. החזק את העובר על ידי גרירה על הצד המנותק קודם לכן, לשבש את רקמת מהצד הנותרים תוך שימוש באותה שיטה (ראה 1.8.). בסיום, לנתק לחלוטין את הרקמה משני צידי עמוד השדרה.
    אלטרנטיבי: לנתק לחלוטין את הרקמה הנותרת בצד שמאל, אבל להשאיר כמה רקמות המצורף בסוף הקדמי ואת האחורי בצד ימין. לפעמים זה יכול לעזור לשמור על חוט השדרה בעמדה בשלב 1.12.
12. מניחים את חוט השדרה על צדו להסיר את רוב רקמת mesenchymal ו DRGs הנותרים (איור 1i).
13. בשלב זה, את קרומי המוח ואת חוט השדרה שני "גיליונות" של רקמת apposed על זה. הצמד מטה גדול יותר, חלק הקדמי ביותר של חוט השדרה, וכן לקלף קטע קצר של קרומי המוח של cor השדרהד (איור 1j, משמאל). עכשיו, החזק את שני פלחי מופרדות תופס פני עם מלקחיים, ומסירה את קרומי המוח בתנועה, חלק קבוע (איור 1j).
    לא אחידה "פילינג" יוביל שבירה של חוט השדרה ו / או שכבת קרומי המוח. זה בדרך כלל לא ניתן לשחזר את החלק של חוט השדרה עדיין מחוברות בקרום המוח.
14. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את חוט השדרה מבודד כדי בצלחת פטרי המכילות L-15 + HiHS 10% ולהשאיר על הקרח. בדרך כלל, מיתרי השדרה של עוברים כל נאספים לפני לנתח את המנות הגבי.

חוט השדרה הגבי לנתיחה

15. מקום אחד חוט השדרה בצלחת פטרי המכילות L-15 HiHS 10%, שוכב בתוך תצורה "ספר פתוח". גזור משם הרחב, החלק הקדמי (הכולל חלק למוח האחורי) (1k איור).
16. הרקמה הגב ממוקם לרוחב, ברוב חלקי של חוט השדרה (איור 1 ליטר, משמאל). בעוד מצמיד את חוט במחט טונגסטן ישר, יש להשתמש במחט בצורת טונגסטן לחתוך רצועה כי הוא 1/5th רוחב של חוט השדרה המחצית. (איור 1 ליטר, מימין). מניחים את רצועות הגב בצינור פלסטיק המכיל 15 מ"ל L-15 + HiHS 10% על הקרח.
    הגב חלקים בצינור העצבי של ~ 12 E13 עוברים תניב ~ 3.5-4000000 תאים ציפוי לאחר ניתוק. תאים נוספים ניתן להשיג על ידי ביצוע נתיחה גס של עמוד השדרה הגבי (חיתוך רצועות הגב הרחב), אבל טוהר נוירון commissural יופחת.

2. Commissural תרבות נוירון

המלצות כלליות

כל הצעדים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים במנדף רקמה תרבות אלא אם צוין אחרת. השתמש בינוני טרי ותוספי שאך מופשר ריאגנטים. דיסוציאציה צעדים טחינה דקה מבוצעות Ca ^{2 +} / ^{2 +} Mg ללא HBSS למזער Ca ^{2 +} / ^{2 +} Mg תלוי הידבקות.

הכנה

• coverslips מצופה (להשתמש בכוס Desag גרמנית) או תרבות צלחות רקמות (ראה בהליך ציפוי להלן).
• חם מדיה ציפוי Neurobasal (ראה להלן), בתרבות מנות רקמות CO ₂ equilibrated ב בתרבית רקמה חממה שעות לפחות 1.5 לפני ציפוי.
• טריפסין 2.5% ב 37 ° C waterbath
• 2 בקבוקי HBSS Ca ^{2 +} / ^{2 +} Mg-free, אחד בכל 4 ° C, אחד בכל 37 ° C.
• two אש זכוכית מלוטשת פסטר pipettes אחד עם בקוטר חצי הגודל כרגיל, ואף אחד בקוטר מעט קטן ממחצית. השתמש מעוקרים pipettes פסטר. כדי להבריק את האש pipettes, להשתמש צורב בונזן (החלק העליון של להבת אור כחול) כדי להמיס את קצה כדי להקטין מעט את הקוטר. מכיוון שלב זה מתבצע מחוץ למכסה המנוע בתרבית רקמה, תרסיס pipettes עם אתנול 70% לפני הצבת מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה. עבור התאוששות יעיל יותר של נוירונים, המעיל pipettes פסטר עם המדיה המכילה סרום לפני תחילת ניתוק או ממש לפני המדרגה טחינה דקה (למלא pipettes עם התקשורת ולשמור למשך 30 שניות). זה ימנע מן התאים דבק הפנימי של פיפטה פסטר במהלך טחינה דקה.
• מים סטריליים milliQ לרחצה PLL מצופה כלים או coverslips
• 12.5% ​​MgSO ₄ פתרון HBSS

פולי-L-ליזין ציפוי

אם אתה משתמש coverslips זכוכית, חומצה לשטוף במשך 24 שעות ו לעקר לפני ציפוי (ראה Kaech והבנקאי, 2006). השתמש הגרמני זכוכית coverslips Desag.

כדי מעיל poly-L-ליזין על coverslips זכוכית או פלסטיק תרבות מנות רקמות:

• מתחת למכסה המנוע תרבית רקמה, מכסים משטחים עם כיפה קטנה של UG 100 / מ"ל ​​PLL פתרון עבור 1.75-2 שעות.
• לשטוף עם מים פעמיים milliQ, לפחות 5 דקות לכל לשטוף (יכול להתבצע במהלך שלב התא דיסוציאציה להלן).
• חנות במים עד לשימוש. אל תתנו את פני השטח PLL מצופה יבש.
  כדי להפחית את בזבוז PLL לציפוי coverslips, המקום coverslips ב חיידקי מנות פטרי סטרילית. מעיל לשטוף את coverslips ידי הצבת הכיפה של נוזל על coverslips. צלחות פטרי חיידקי הם הידרופובי, לכן הנוזל צריך להישאר על coverslips זכוכית. מעבירים את coverslips למנות בתרבית רקמה רק לפני ציפוי התאים.
  עבור נוירונים מצופה על צלחות פלסטיק תרבות רקמה, הדבקה הוא בדרך כלל גבוה יותר, התארכות neurite ובכך עשוי להצטמצם.

דיסוציאציה ו ציפוי

1. ודא כי יש רצועות הגב התיישבו אל החלק התחתון של הצינור. הסר את רוב HiHS L-15 10% עם פיפטה פסטר. מהר לשטוף את רצועות הגב בצינור העצבי פעם על ידי הוספת 3 מ"ל של קר (4 ° C) HBSS.
2. תנו את רצועות הגב בצינור העצבי להסתפק 2 דקות, ואז להסיר את HBSS עם פיפטה פסטר.
3. הוסף חמים (37 מעלות צלזיוס) HBSS לנפח של 4.7 מ"ל. Tתרנגולת להוסיף 0.3 מ"ל של 2.5% טריפסין לתת הריכוז הסופי של טריפסין 0.15%.
4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס waterbath דקות 7. מערבבים פעם אחת בעדינות חצי דרך הדגירה.
5. הוסף 30 μl DNAse (25 000 U / mL) ריכוז סופי של 150 U / mL. הוסף 60 μl של MgSO ₄ ומערבבים בקצרה, ריכוז סופי של 0.15%.
   עבור רקמה והניתוחים גס, דגירה דקה 1 תוספת על 37 מעלות צלזיוס waterbath.
   
   בשלב זה, חלקים הגבי בצינור העצבי צריך להיות מקוטעת. אם בסעיפים הגב בצינור העצבי לא החלו שבר, זה בדרך כלל משמעות הדבר היא כי מניות טריפסין 2.5% הוא זקן, מלאי חדש צריך להיות מופשר, או לשטוף עם HBSS קר לא יעילה להסיר את HiHS מן המדגם.
6. צנטריפוגה שברי רקמה על g 200 דקות 4.
7. הסר את supernatant עם פיפטה פסטר, עוזב ~ 50-100 μl של נוזל בתחתית הצינור.
8. פליק הצינור בעדינות כדי לשחרר את הכדור, ואז לשטוף את התאים על ידי הוספה של 5 מ"ל HBSS חם. בואו להתיישב בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
9. צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות.
10. הסר את supernatant עם פיפטה פסטר, עוזב ~ 50-100 μl של נוזל בתחתית הצינור.
11. פליק הצינור בעדינות כדי לשחרר את הכדור באופן חלקי resuspend התאים. לאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של HBSS חם.
12. השתמש קטנים (בקוטר של חצי) אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר לנתק את התאים על ידי לאט pipetting מעלה מטה 4-6 פעמים. הימנע עושה בועות, ו פיפטה את הנוזל על הצד של הצינור. אל מעל triturate.
13. השתמש אש מלוטש הקטן זכוכית פיפטה פסטר נוספת לנתק את התאים על ידי לאט pipetting מעלה ומטה 3-4 פעמים. הימנע עושה בועות, ו פיפטה את הנוזל על הצד של הצינור. אל מעל triturate.
    עבור רקמה והניתוחים גס, להוסיף 1 מ"ל תוספת של HBSS חם הצינור בסוף ניתוק.
    כאשר dissociating התאים, אין צורך לנתק את כל גושי התאים אגרגטים. עצור pipetting מעלה מטה או שינוי פיפטה פסטר בקוטר קטן יותר אם אתה לא רואה שום ירידה נוספת בגודל של המצרפים תא עם pipetting נוספת.
14. בואו כל שברי הרקמה הנותרת להתיישב בצינור דקות 1. אין צורך להעביר את התאים צינור חדש.
15. קח 20 μl של השעיה התא להוסיף 5 μl של trypan כחול. ספירת תאים על haemocytometer.
    נוירונים יש ≥ 95% קיימא על ידי הכללת כחול trypan.
16. פלייט הנוירונים ב-Media ציפוי Neurobasal (ראו מתכון בהמשך).
    • ציפוי צפיפויות הצעה לקבלת נוירונים בודדים (צפיפות נמוכה תרבויות להימנע נוירונים clumping או חופפים זה לזה):
    • 120 000-180 000 תאים / היטב צלחת 6 טוב
    • 60 000-75 000 תאים / 12 צלחת היטב היטב
17. 16-18 שעות לאחר מכן, לשנות את המדיה Media צמיחה Neurobasal (ראו מתכון בהמשך)
    אין להשתמש משאבת ואקום כדי לשאוב את התקשורת מצלחת התרבות כאשר משתנה התקשורת; בעדינות להשתמש פיפטה. זה ימנע פירוק נוירונים.

נציג תוצאות:

ארבע שעות לאחר ציפוי, הנוירונים צריך דבקו poly-L-ליזין (PLL) מצופה משטח. תחת תאורה בניגוד שלב, גופי התא דבק בדרך כלל שטוח יחסית סגלגל (איור 2 א). תאים שלא דבק היטב לכדורים כי המהלך מעט כאשר את המנה הוא טפח בעדינות בצד. גורמים רבים עלולים לעכב את הידבקות של תאים (ראה דיון).

לאחר 30 שעות במבחנה, רוב הנוירונים הרחיבו האקסון עם חרוט צמיחה גלוי (תאנה 2c, ד). אם הצמיחה axonal עני הוא ציין, ודא כי המדיה צמיחה Neurobasal נעשה עם המדיום ותוספי טריים. נוירונים להישאר בריאים במשך לפחות 6 ימים בתנאים האלה. הליך זה הוכח בצורה אמינה תשואה ההכנות מועשר בנוירונים commissural, עם ~ 90% של נוירונים להביע DCC (ים et al. 2009). רוחב פס בחוט השדרה הגבי המשמש להכנת ההשעיה תא ישפיע על טוהר התרבות, עם טוהר יותר כאשר רצועות רזה משמשים. יישום דוגמה מוצגת דמות 3 (immunofluorescence). ראה את המאמר על ידי ים et al. (2009) לדוגמאות נוספות.

באיור 1. שרטוטים של צעדים לנתיחה חוט השדרה. D = הגבי, V = הגחון. לחץ כאן כדי לראות דמות גדולה.

איור 2. התוצאה נציג commissural מבודדנוירונים מצופה על coverslip PLL מצופה זכוכית. a, b) 4 שעות לאחר ציפוי, הנוירונים דבקו אל פני השטח. בר = 20 מיקרומטר. ג, ד) 30 שעות לאחר ציפוי, רוב הנוירונים הרחיבו האקסון עם חרוט צמיחה גלוי. בר = 20 מיקרומטר.

איור 3. נוירון commissural immunostained עבור טובולין גמא (ירוק), עם אקטין-F שכותרתו ידי phalloidin (F-אקטין, אדום) על ידי גרעין DAPI (כחול).

מתכונים והערות

ציפוי מדיה Neurobasal

• Neurobasal
• 10% חום מומת FBS (HiFBS)
• 2 מ"מ L-גלוטמין (מפתרון 200 מניות mM)
  אופציונלי: אנטיביוטיקה פניצילין / סטרפטומיצין (להשתמש במחצית ריכוז נורמלי)

צמיחה מדיה Neurobasal

• Neurobasal
• B27 (1 / 50 דילול של המניות)
• 2 מ"מ L-גלוטמין (מפתרון 200 מניות mM)
• אופציונלי: אנטיביוטיקה פניצילין / סטרפטומיצין (להשתמש במחצית ריכוז נורמלי)
  
  ברגע התקשורת מתבצעת, זה יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. כדי לאזן את הטמפרטורה ואת ה-pH של התקשורת לפני ציפוי התאים, מדיה מקום בתרבות צלחות פטרי רקמות מקום בתרבות רקמה חממה לפחות 1.5 שעות.

Neurobasal

אחרי בקבוק בינוני Neurobasal נפתח, הוא יכול להישמר למשך חודש אחד ב 4 ° C בחושך. השלך Neurobasal אשר נפתח למשך חודש אחד או יותר אחרת הישרדות התא יהיה נמוך יותר.

חום מומת בסרום שור העובר (HiFBS) או סוס בסרום (HiHS)

כדי להשבית חום FBS או HS, חום 56 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות. הבקבוק מערבולת בערך כל 10 דקות בערך. (לקבלת דיוק להשתמש בקבוק בגודל דומה מלא מים. פלייס מדחום בבקבוק מים לראות מתי 56 ° C הוא הגיע. בגין תזמון בשלב זה.) חום מומת FBS ייתכן שיהיה צורך לנקות משקעים centrifuged, ו ניתן aliquoted מחדש קפוא ב -20 ° C.

L-גלוטמין

תמיד הפשרה aliquot טריים של גלוטמין-L עבור כל ניסוי.

B27

Aliquots של B27 יכולים להישמר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח, או 4 ° C למשך חודש אחד.

Discussion

תיארנו שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה עכברוש עובריים. הליך זה נעשה שימוש שגרתי במעבדה שלנו באופן מהימן להכין נוירונים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של הדרכה האקסון. עבור ביולוגיה של התא וניסויים immunochemistry, דיסקציה של פסולת מהן מניבה מספיק נוירונ...

Materials