הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Summary

נוהל זבול Xenopus ביציות לפי שיטת העברת המארח.

Abstract

הלומד את תרומתה של מולקולות בירושה אימהי על התפתחות החולייתנים הראשונים נפגעת לעתים קרובות על ידי הזמן וההוצאות הדרושים כדי ליצור חיות השפעה אימהית מוטנטי. בנוסף, רבים של טכניקות כדי overexpress או לעכב תפקוד הגן באורגניזמים כגון Xenopus ו דג הזברה מצליחים מספיק יעד קריטי מסלולי איתות אימהית, כגון איתות Wnt. ב Xenopus, מניפולציה לתפקד גנים ביציות בתרבית ולאחר מכן זבול אותם ניתן לשפר את הבעיות הללו במידה מסוימת. ביציות הן defolliculated ידני מרקמת השחלה התורם, הזריק או מטופל בתרבות כפי הרצוי, מגורה אז עם פרוגסטרון כדי לזרז הבשלה. לאחר מכן, ביציות הן הציג לתוך חלל הגוף של צפרדע מארח הביוץ הנשי, ואז הם יהיו translocated דרך oviduct של המארח ולרכוש שינויים ומעילים ג'לי הכרחי הפריה. עוברים שהתקבל לאחר מכן ניתן להעלות לבמה הרצוי ניתחו את ההשפעות של כל הפרעות ניסיוני. שיטה זו המארח להעביר כבר יעיל מאוד בחשיפת המנגנונים הבסיסיים של ההתפתחות המוקדמים, ומאפשר מגוון רחב של אפשרויות ניסיוני אינו זמין בכל אורגניזם מודל חוליות אחרים.

Protocol

1. הסרה כירורגית של השחלות רקמות

1. הכן קבוצה חדשה של המדיום תרבות הביצית (OCM; חומרים), בין 400-800 מ"ל תלוי בגודל של הניסוי. התאם את ה-pH על 7.6-7.8, עד פנול אדום הופך צבע אדום כהה (שישה או כך טיפות קטנות של 5N NaOH). שפוך כמות קטנה כדי לבדוק את רמת החומציות בצינור נפרד מאז אלקטרודות pH עלול לזהם את התקשורת. OCM צריך להיות מאוחסן על 18 ° C בשימוש בתוך שבוע.
2. בחר 3-5 נקבות במקום אחד ~ פתרון 2L הרדמה שנאגרו (חומרים). אנחנו מנסים להימנע משימוש הצפרדעים הואכלו ביום או לפני ניתוח. בעוד הצפרדע הוא נכנע ההרדמה, לחטא את אזור הניתוח עם EtOH 70% ולהכין את מכשירי ניתוח.
3. לעקר את מכשירי ניתוח על ידי טבילה 20-השני מעקר חרוז חם ב 250 ° C. המכשירים הבאים צריך להיות על יד: להתמודד עם אזמל (# 3) להב (# 10 או 11), כמה זוגות של דומון מלקחיים, בון איריס מספריים (מעוגל או ישר), או האלסי אולסן-Hegar בעל מיקרו מחט, ותפרים. המקום מכשירים מעוקרות על צלחת פטרי סטרילית או בחלק הפנימי של החבילה תפר כדי לשמור על סטריליות. תפוס את המחט מחזיק את המחט בכיוון הרצוי לפני תחילת. אנחנו מעדיפים אולסן-Hegar מחזיקי מחט מאז לטפל מכיל להבי מספריים, אשר ניתן להשתמש בהם לקצץ התפרים ללא מכשירים מיתוג.
4. לאחר 10 דקות, לבדוק כי מטוס של הרדמה כירורגית הושגה. צפרדעים הרדים יפסיק לנוע ולא יגיב קמצוץ הבוהן או להיות התהפך. הרדמה צריך להימשך 15 דקות, וזה די והותר זמן לבצע את הפעולות. דון הלבוש כירורגי מתאים. זה יכול לכלול כפפות נקיות (לא לטקס), חלוקי מעבדה, ומסכות כירורגית, תלוי העדפה אישית ומוסדית הנחיות לטיפול בבעלי חיים.
5. הערה על הטכניקה aseptic: הפרשות העור צפרדע מכילים פפטידים מיקרוביאלית כי בדרך כלל להפחית את שכיחות הזיהום במהלך הניתוח, למרות הטכניקה aseptic יש לפעול ככל הניתן. וילונות כירורגי יכול לשמש, אבל לא ייתכן שתידרש על ידי IACUCs מוסדיים לא יכול לספק תועלת רבה. בדרך כלל "טכניקה טיפ" השתמשו, שם את ידיו לגעת טיפים סטרילית של החומר, מכשירים תפר או חתך האתר. מכשירים ניתן resterilized (ב מעקר את החרוז) החתך הבא של העור, אזור סטרילי יש לשמור על benchtop עבור הצבת מכשירים (כמו צלחת פטרי או חבילת תפר). דרישות המוסדיים יכולים להיות שונים באופן משמעותי, ולכן עליכם לעקוב אחר הנחיות מוסדות "שלך לקבל הדרכה מתאימה לפני ביצוע ניתוחים.
6. הסר את הצפרדע מן ההרדמה מקום שכיבה על הגב כירורגית לח לנגב. הערה. העור ניתן לנקות ע"י שטיפה של יוד povidine מדוללת (01:20) או chlorhexidine (0.75%). עם זאת, להימנע מסכת מנתחים מסחרי, סבונים ו -70% אלכוהול איזופרופילי, כמו אלה יפגע בעור העדין של דו חיים.
7. בעזרת מספריים או אזמל קטן איריס, להפוך קטן (1 - 1.5 ס"מ) חתך בעור בחלק התחתון של הבטן, לרוחב קו האמצע. בעקבות חתכים על צפרדע אותו יש לבצע על הצדדים לסירוגין, במרווחים גם אחד מהשני. חתכים יכול להתבצע גם במקביל או בניצב לקו האמצע.
8. הפוך את העור ואת שרירי הבטן חתכים בשני שלבים. לאחר חיתוך העור, להסיר את שכבת השרירים המקיפים בצבע לבן fascia עם מלקחיים ולעשות את החתך בשריר העלה. השתמש מספריים לחתוך ישר למטה, מנסה לעשות חתך אחד מהיר לחשוף את חלל הגוף משאיר קצוות הפצע נקי. אם רק fascia היא לחתוך, זה יהיה לסגת ויעשה תפירת קשה יותר. הרמת השריר תסייע למנוע בשוגג ופצע כל האיברים הפנימיים. כמו כן, מנסים להימנע מכל דרך חיתוך לבבות הלימפה גלוי או כלי דם בתוך שכבות השריר. הארך את משך במספריים של החתך כך השחלה יכול להיות משך בקלות דרך.
9. השחלה צריך להיות לעין פעם את החתך נעשה. כדי להשיג את השחלה, לתפוס עם מלקחיים להחצין את רקמת השחלה. הכמות הרצויה של רקמות מוסר, וגזוז מעל ברמה של קיר הגוף. אל החומר רקמות בחזרה לחלל coelomic, כמו זה יכול להיות מקור של זיהום או סיבוכים אחרים.
10. מיד רואים פיסה קטנה של השחלה תחת מיקרוסקופ הניתוח, defolliculate כמה ביציות כדי לבדוק את איכותם. הם צריכים להיות תקיפים של גודל צבע אחיד. אם הם מקובל, להסיר את הכמות הרצויה של רקמת השחלה ועל תפר את החתך. מספיק כדי למלא צלחת פטרי 90 מ"מ הוא בדרך כלל מספיק עבור רוב הניסויים. אם ביציות הן באיכות מפוקפקת, תפר את הצפרדע וחזור עם נקבה אחרת.
11. סגירת החתך על ידי תפירת השרירים שכבת fascia הראשון. הכנס את n eedle כמה מילימטרים לרוחב החתך, מוודא לעבור דרך שכבת fascia גם כן. Sutures רק דרך השריר עלול לקרוע את הרקמה השתחרר. שימוש במלקחיים כדי לעזור להכניס את המחט מלמטה בצד השני של החתך. שחרור מחדש לתפוס את המחט מחוץ לגוף ומשוך תפר דרך עד כמה סנטימטרים בערך של הזנב נשאר, נזהרת לא למשוך אותו לאורך כל הדרך.
12. סגור את הפצע עם דפוס קטע פשוט של תפירת. אנו משתמשים עניבה מכשיר בסיסי כדי להפוך קשרים מרובע של המנתח (קשרים שונית). לופ סוף ארוך של תפר סביב בעל מחט, לתפוס את הזנב למשוך אותו דרך הלולאה כלפיך והדק. לולאה דרך למשוך שוב, הפעם למשוך בעל מחט ממך. לזרוק שלישית יכול לשמש תוספת הביטחון (באותו כיוון כמו הראשונה). חתוך את תפר, משאירים זנב קצר אחר לעשות תפר בשריר מילימטרים ספורים. שני התפרים הם מספיק תפרים קטנים; שלוש הגדולות. חזור על שכבת העור. הדגמות וידאו של טכניקת תפירת בסיסיים זמינים ב-YouTube - חיפוש אחר "לקשור מכשיר", יש לא מעט לבחירה, אם כי את הטכניקה הבסיסית זהה.
13. לשטוף עם מים הנשי deionized ואת מקומה בדלי התאוששות מלאה קריר (18 מעלות צלזיוס) מים. בעוד במעבדה, צפרדעים נשמרים במי ברז שטופלו Amquel להסיר chloramines. כל כמה דקות, להרים בעדינות את הצפרדע מן המים ולחפש בולע או תנועות עיניים בולטות, מעיד על ההתאוששות מן ההרדמה.
14. הערה: ניתוח הישרדות לא הכרחי כדי להשיג רקמות השחלה, אם כי הנקבות תמשיך לייצר ביציות טוב לאחר מספר פעולות. ביצוע ניתוח ההישרדות גם לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים. הקפידו למלא אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים שלך על חוליות של יחידת הניתוח שיטות הישרדות, מנותחות טיפול ניטור עבור מספר ניתוחים מותר על יחיד.

2. Culturing וביציות Defolliculating

1. מיד לאחר הניתוח הוא סיים, לחלק את השחלה לחתיכות קטנות (~ 2 ס"מ ²⁾ ו חנות OCM טרי, באמצעות 5-6 חתיכות לכל צלחת 90 מ"מ. האונות בודדת של השחלה נחתכים פתוח, שטוח החוצה לחתוך לחתיכות מרובעות. אלה ושטף OCM נקי והניח בצלחות לתרבות. שיטוח וחלוקת את השחלה יהיה להאריך את חיי התרבות שלה ולעשות defolliculation קל.
2. העברת האונה אל צלחת קטנה של OCM באופן ידני defolliculate 300-500 ביציות. העברת ביציות באמצעות סטרילי, אש מלוטש פיפטה. מצאנו כי באמצעות מגוון כותנה פקוק חיונית לצמצום זיהום של תרבויות. חנות ביציות בגיל 18 ° C ב 8 מ"ל OCM (במאכלים בינוני (Falcon 1007)) בקבוצות של 100-150. עם תרגול, אתה אמור להיות מסוגל defolliculate ביציות מספיק 1-2 שעות. ביציות Collagenased אינם מתאימים להעברת מארח מאז הם לא להיות fertilizable.
3. Defolliculating שיטה. אנו defolliculate באמצעות מלקחיים "שענים (דומון 4S # או # 5s, כלי המדע פיין), בעקבות השיטות הבסיסיות שתוארו סמית. Et al (1991). זוג אחד של שימוש במלקחיים (ביד הדומיננטית שלך), לתפוס את שכבת רקמת חיבור theca סביב מלא גדל השישי בשלב הביצית ליד המקום שבו זקיק מחובר אל השחלה (גבעול). עם זוג השני של מלקחיים, לתפוס את השחלה הסמוך זוג הראשון. קלות דמעה לפתוח את שכבת זקיק ידי משיכת מעבר הביצית. בעדינות להקניט את הביצית מתוך הרקמה. ביציות defolliculated בהצלחה הם floppier יותר ביציות פשוט הוריד מבלי להסיר את שכבת זקיק ויהיה נטול כלי דם גלוי.
4. הערה: זה חיוני כדי לשמור על לחץ קל מאוד על קצות המלקחיים, בקושי מספיק בשביל לפגוש את הטיפים. נאחז חזק מדי היא נפוצה בקרב למתחילים תגרום הביצית עתה התרחקה עם זקיק ללא פגע. שמור זוג טוב של מלקחיים בלעדי defolliculating. טיפים צריכה לפגוש דווקא ויש מעט בוטה יותר מלקחיים להפיכת explants מעוברים Xenopus (איור 1).
5. אנו שגרתי מבחן בוגר כ -20 עם פרוגסטרון להפיל את הניסוי אם קצב ההבשלה הוא עני (<50% אחרי 6-7 שעות בטמפרטורת החדר).
6. בנקודה זו, ביציות ניתן להשפיע ותרבותיים כרצונכם, כגון microinjection של אוליגו, morpholino או mRNA. נהלים הזרקת להשתנות לכל מעבדה, ולכן אנו לא אתאר אותם כאן. ביציות יכול להישמר עד שבוע OCM, אבל בדרך כלל בריאות ירידות ולכן עדיף להשתמש בהם להעברת בתוך 96 שעות של בדידות.
7. זכור כי רק חמש עד שש קבוצות (כולל בקרה) ניתן להעביר נקבה אחת, בשל מגבלות על צבעים חיוניים, ולכן תוכנית הניסויים שלך בהתאם.

"> 3. הביצית ההתבגרות גירוי של נקבות מארח פרוספקטיבי

1. אם מבצע ההצלה של דלדול אוליגו, מזריקים mRNA שלך (בדרך כלל 5-30 עמ 'רנ"א) ~ 24-48 שעות לאחר אוליגו. Oligos תהיה מושפל על ידי זמן זה לא אמור להשפיע על RNA מוזרק.
2. בערב לפני ביצוע ההעברה, להוסיף 16 μL של פתרון פרוגסטרון עבודה (1mm ב EtOH) כדי ביציות ב OCM 8 מ"ל במאכלים בינוני (ריכוז פרוגסטרון הסופית היא ~ 2 מיקרומטר). דגירה 10-12 שעות ב 18 ° C כדי לאפשר הביצית הבשלה.
3. הזרק 3-5 נקבות עם 1000 יחידות צפרדע של hCG לגרום הנחת ביצה. הניסויים שלנו נראה לעבוד טוב יותר אם הבשלת הביצית הזרקת hCG נעשים בערך באותו זמן, בערך 12 שעות לפני ההשתלה לתוך המארח (לדוגמא, 22:00 AM -10). השאר נקבות ב RT או 18 ° C במשך הלילה.

4. הכנה מכתים דיי ויטל של ביציות

1. בבוקרו של ההעברה, לאפשר ~ 45-60 "להגדיר לבצע את ההליך. בנקודה זו, ביציות בוגרות אפשר להקפיא ניתוח מאוחר יותר של יעילות של מציאה mRNA או ביטוי חלבון. כמו כן, לבדוק ביציות לא להידבק וזה היה שיעור טוב ההבשלה (> 50%). אינפקטד ביציות לא להפרות. הפשירי צבעים חיוניים (חומרים) וכן להסתובב במהירות מקסימלית של 5 דקות.
2. צבע שונה קבוצות הניסוי על ידי הוספת 80 μL של צבע החיוני המתאים (ים) את הכלים ואת הביצית דגירה עם נדנדה עבור 15 ". במהלך תקופה זו, בחר נקבה המארח להתחיל בהרדמה. בחר צפרדע זה לאט להטיל ביצים בדרך כלל או אחד שמייצר ביצים בשפע עם סחיטה קלה. ביצים של המחשב המארח צריך להיות באיכות טובה. המנעו נקבות כי הם מניחים מחרוזות של ביצים או ביצים מרוסקות.
3. מעבירים את הביצים בצבע לצלחת גדולה של OCM טריים, מערבולת בקצרה לשטוף ולהגדיר אותם בצד לפני ההעברה.
4. הכן סטרילית פיפטה פסטר עם משעמם רחב מספיק כדי להכיל את הביצית (~ 1.5 מ"מ) לשימוש השתלת ביציות. ציון פיפטה בעיפרון יהלומים לשבור למשעי. אש פולנית עד הקצוות חלקות, נזהרת שלא להמיס פתיחת סגור.

5. ביצוע השתלת הביצית

1. השתלת הביצית משתמש ניתוחים אותו כמתואר חלק, אם כי במקום הסרת שחלות, ביציות מניפולציות מוכנסים חלל הגוף עם טפטפת. באופן אידיאלי, הליך ההעברה צריכה להתבצע במהירות האפשרית ואת גודל החתך צריך להישמר קטן ככל האפשר.
2. Anesthesize הנשי לארח ולהכין מכשירי ניתוח כמתואר חלק א ביצוע החתך כמתואר בחלק א החתך יכול להיות קטן, אבל צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים נשא של פיפטה העברה (איור 2 א).
3. לשם השתלת ביציות, אחוז ולרומם one דש של שרירים fascia עם מלקחיים ולהציג את ניסיוני ביציות באמצעות פיפטה פסטר מוכן לעיל. מערבולת את המנה של ביציות כדי לאסוף אותם במרכז להתחנף כמה שיותר. אפשר ביציות כדי להתיישב סוף פיפטה כדי למנוע נוזל עודף שהוצגה והכנס את קצה פיפטה לתוך החתך לאט לאפשר ביציות כדי לטפטף לתוך חלל הגוף (תרשים 2B). חזור על הפעולה עד שכל ביציות הועברו. אין לשחרר את שכבת השריר בכל עת, עד התחלת תפירת, או ביציות תישפך מתוך החתך.
4. לאחר ביציות הועברו, לתפוס את שני הצדדים של החתך עם מלקחיים ולהביא אותם יחד, המאפשר ביציות להתיישב לתוך חלל הגוף. בגין תפירת כמתואר, דואג לשמור על מתח כלפי מעלה על השריר fascia עד הקשר הראשון הוא קשור (איור 2C). זה ישמור על ביציות של שגורשו החוצה יאפשר את שולי החתך לרפא באופן שווה. הוסף עוד תפר בשכבה שריר / fascia ואז תפר את העור.
5. לשטוף עם מים הנשי deionized והמקום שלה בתוך דלי מלא מים התאוששות מקורר Amquel שטופלו (° C 18). צג החלמתה מן ההרדמה לעיל. היא צריכה להתחיל להטיל ביצים בדרך כלל לאחר הניתוח.
6. השג האשכים של צפרדע זכר באמצעות הליכים רגילים. אחסן את האשכים ב OCM או L15 עד הצורך. אנחנו מעדיפים testis טרי כאשר זבול ניסויים ההעברה.

6. שחזור של ביציות ו הפריה חוץ גופית

1. Cilia פריטוניאלית יניעו את הביצים הועברו (וביצים coelomic נורמלי של המארח) על הפתחים של oviducts ב הקדמי של חלל הגוף. ביצים צבעוניות ניתן לשחזר בתחילת 2-3 שעות לאחר ההעברה על ידי כיווץ נורמלית. ביצים ניתן להשיג כל חצי שעה בערך עד שהנקבה מפסיקה להטיל.
2. לדשן ב speההשעיה rm (ב ~ 4 מ"ל 1x MMR) עבור 4 דקות. המבול ולשטוף בהרחבה MMR 0.1x. ביצים צריך להפעיל כרגיל יתחילו לדבוק ~ 1.5-2 שעות לאחר ההפריה. הביצים הועברו בדרך כלל לדבוק מעט מאוחר יותר מאשר לארח את הביצים.
3. הסר את המעילים ג'לי עם ציסטאין כמו עוברים נורמלי ולמיין לתוך מנות נפרדות. ניתן לעשות זאת בכל שלב, בהתאם לצרכים של הניסוי. זה בדרך כלל קל לזהות את הצבעים השונים סביב הבמה 4-התא הקשה ביותר בשלבי blastula מאוחר. תרבות ביצים בצפיפות נמוכה (<50 לכל צלחת בינונית) ב MMR 0.1x נקי. מנקודה זו, ניתן לטפל עוברים מניפולציות כרגיל.
4. מחזירים את הצפרדעים למתקן בעלי חיים לפקח על סיבוכים במהלך הימים הקרובים.
5. הפריה שיטה חלופית; ההטלה במאגר מלח גבוהה
   1. אחרי הצפרדע התאושש מההרדמה, מקומה לתוך ~ 1 ליטר גבוהה מלח MMR (1.2x). אפשר הנקבה להטיל ביצים לתוך המאגר כ 4-6 שעות. לסחוט את הביצים הנותרות, ניקוז MMR 1.2x ולמיין ביצים צבעוניות לתוך צלחת נקייה, להסיר את כל נוזל אפשרי.
   2. לשטוף בהרחבה MMR 0.3x ולדשן בהיקף מינימלי של השעיה MMR / זרע 0.3x עד להפעלת ביצים (10 דקות). המבול עם MMR תרבות 0.1x ו לעיל. אפשרות זו שימושית אם ביצים רבות יש צורך בשלב זהה או אם הביטוי ידנית של ביצים פוגעת ביציות התורם.

Discussion

העברה מוצלחת תגרום דישון מחשוף נורמלי של 50%> של ביציות (איור 3). בדרך כלל בין 30-60% של ביציות הועבר ישרדו בעבר בשלבים neurula. אנחנו בדרך כלל להעביר 75-150 ביציות לכל קבוצת הניסוי, אשר תניב עוברים מספיק מספר סוגים של ניתוח (באתרו, RT-PCR) וכן לדמיין את הפנוטיפ. השתלת ביציות באופן מש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% L-15 של ליבוביץ בינוני (המכיל L-גלוטמין)	(Invitrogen 11415-064)
0.4 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA, חלק V)	(Sigma A-9418-50 גרם)
1x פניצילין, סטרפטומיצין	(Sigma P-0781)
התאם את ה-pH 7.6-7.8 עם 5N NaOH
בצע טרי בחנות שבועי, בשעה 18 ° C.

NaCl 1M

20 מ"מ KCl

20 מ"מ CaCl 2

10 mM MgCl 2

150 mM HEPES

להתאים את ה-pH 7.6-7.8

חנות ב -4 ° C

1 גרם / L 3-Aminobenzoic חומצה קראטין אתיל אסתר (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g / L נתרן ביקרבונט
מתמוססים במים Amquel שטופלו
בצע טרי שבועי

10 mM הפרוגסטרון (Sigma P-0130) ב 100% אתנול

מדולל עד 1 מ"מ ב EtOH 100% במניה 500x / עובדים פתרון

חנות ב -20 ° C

כחול: 0.1% הנילוס הכחול	(אולדריץ 121479-5G),
אדום: אדום ניטרלי 0.25%	(סיגמה N-6634)
בראון: 1% ביסמרק בראון	(Sigma B-2759)
גרין (80 כחול + 80 μl חום μl),
במוב (80 μl כחול אדום + 80 μl).
צבע השישי, אורנג' (80 μl אדום + חום μl 80), יכול לשמש גם אבל לעתים קרובות קשה להבחין בין חום.