A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
וידאו זה מדגים את הכנת תרביות נוירונים העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. צפיות של תרבויות לחיות להראות תוצאה neurite הדמיה של רמות הסידן באמצעות Fura-2.
בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת תרבויות העצבית העיקרי של המוח של המנוח בשלב תסיסנית גלמים. ההליך מתחיל עם סילוקו של מוחות מחיות ב 70-78 שעות לאחר היווצרות puparium. המוח מבודד מוצגים לאחר דגירה קצרה papain ואחריו שוטף מספר בינוני סרום ללא צמיחה. תהליך ניתוק מכני של המוח כל טיפה 5 ul של התקשורת על coverslip מודגם. האקסונים והדנדריטים של הפוסט mitotic הנוירונים התרחק ליד סומה במהלך דיסוציאציה אבל הנוירונים מתחילים מחדש תהליכים בתוך כמה שעות של ציפוי. תמונות להראות תרבויות לחיות 2 ימים. נוירונים להמשיך לפרט תהליכים במהלך השבוע הראשון בתרבות. אוכלוסיות נוירונים מסוימים ניתן לזהות בתרבות באמצעות GAL4 קווי לנהוג ביטוי רקמות ספציפיות של סמנים ניאון כגון GFP או RFP. הקלטות שלמות התא הדגימו את נוירונים בתרבית טופס פונקציונלי, סינפסות cholinergic ו GABAergic פעיל באופן ספונטני. קטע וידאו קצר ממחיש הדינמיקה סידן נוירונים בתרבית באמצעות Fura-2 כמו צבע אינדיקטור סידן לפקח הארעיים סידן ספונטנית ניקוטין התגובות סידן עורר בצלחת של נוירונים בתרבית. אלו תרבויות המוח גלמי הם מערכת מודל שימושי אילו כלים גנטיים תרופתי יכול לשמש כדי לזהות גורמים פנימיים וחיצוניים המשפיעים על היווצרות ותפקוד של סינפסות המרכזית.
הכנות לפני יום culturing:
ביום של culturing
I. הכן פתרון אנזימים (ES) במנדף תזרים למינרית
השנייה. הפוך את DDM2 התקשורת
ביום של culturing: להוסיף את התוספים הבאים כדי DDM2
עד 10 מ"ל של DMEM להוסיף את התוספים, ממש לפני culturing:
הערה: בצע מספיק DDM2 לכל התרבויות המתוכנן (כל המוח מצופה על coverslip יחיד צלחת פטרי 35 מ"מ בודדים, 1.5 ms התקשורת / תרבות)
שלב III-VI יכול להיות על הספסל נעשה במעבדה nonsterile ואמור להסתיים תוך 45 דקות או פחות.
ג. אוסף גלמים
הערה: אנו משתמשים בדרך כלל במוחם של גלמים בין 55-78 שעות לאחר היווצרות puparium (APF). זה מעט קשה יותר לנתח את המוח של גלמים הצעיר מאז כמוסות ראש נוטים לקרוס, בעוד הרמה הכללית של תולדה neurite נמוכה מעט מ גלמים הבכור. בשנת המתח wildtype קנטון-S, בשלבים אלה מוכרים על ידי פיגמנט בעיניים כי הם חום בהיר עד מעט אדמדם, עם פיגמנט מעט במקום אחר.
IV. עריפת ראש תחת מיקרוסקופ לנתח
V. הסרת המוח מהראש תחת מיקרוסקופ לנתח
VI. הסרת אונות אופטיים וטיפול אנזים
בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית סטרילי - כל השלבים שבו רקמה חשוף לאוויר צריך להיעשות ברדס זרימה למינרית עבור השלבים הנותרים.
VII. כביסה
VIII. טחינה דקה ו ציפוי תחת מיקרוסקופ לנתח
IX. האכלה תאים
נוירונים שנקטפו מן המוח של מכרסמים עובריים / לאחר הלידה ניתן לגדל בתרבית תאים העיקרי שבו הם להאריך neurites וליצור קשרים סינפטיים תפקודית. שיטות הכנה של תרבויות אלה מבוססים היטב מחקרים בתרבויות מכרסם העצבית יש תפקיד קריטי בזיהוי גנים וגורמים סביבתיים מעורבים ויסות היווצרות פונקצי...
עבודה זו נתמכה על ידי NIH כדי להעניק NS27501 DKOD. תמיכה נוספת עבור עבודה זו סופק על ידי מענק קליפורניה תמיכה DKOD באמצעות תוכנית פרופ HHMI.
Coverslips לציפוי: לשים coverslips autoclaved בצלחת פטרי 60 מ"מ. 5 Pipet ul של קון תערובת / Laminin על מרכז coverslip כל אחד. מקום 37 C החממה למשך 2 שעות. לשטוף coverslips 3x עם ul 100 מים autoclaved כל אחד. השתמש ואקום המצורפת pipet פסטר סטרילית. במהלך השטיפה האחרונה, להרים את coverslip עם מלקחיים ויבש שני הצדדים. מעבירים את coverslip כדי בצלחת פטרי 35mm. אחסן בטמפרטורת החדר עד חודש.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved