דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

Summary

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך כלל ג elegans מחקר. המתואר הוא פרוטוקול פשוט, אך יעיל, להציג transgenes לתוך תולעים באמצעות הפצצה biolistic עם DNA מצופה חלקיקי זהב. המאמץ הכרוך ואת התוצאות של הפצצה להשוות לטובה עם microinjection עבור הדור של חיות טרנסגניות.

Abstract

מספר מעבדות באמצעות C. חינם נמטודות חיים elegans הוא הולך וגדל במהירות. הפופולריות של הדגם הזה ביולוגי מיוחסת זמן הדור מהירה תוחלת חיים קצרה, תחזוקה קלה וזולה, רצף גנום מלא, מערך של RNAi משאבים בעלי חיים מוטציה. בנוסף, ניתוח של C. elegans הגנום גילה דמיון רב בין תולעים חוליות גבוהה, אשר טוען כי מחקר תולעים יכול להיות נספח חשוב מחקרים שבוצעו בעכברים כולו או תאים בתרבית. חלק חזק וחשוב של מחקר תולעת הוא היכולת להשתמש חיות טרנסגניות ללמוד לוקליזציה גן ותפקוד. בעלי חיים מהונדס ניתן ליצור גם באמצעות microinjection של germline התולעת או באמצעות הפצצה biolistic. הפצצה היא טכניקה חדשה והיא מוכרת פחות למספר מעבדות. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר תולעים מהונדס בהפצצות biolistic עם חלקיקי זהב באמצעות Bio-Rad PDS-1000 המערכת. בהשוואה microinjection דנ"א לתוך אנדרוגינוס germline, פרוטוקול זה יש את היתרון של לא דורש כישורים מיוחדים ממפעיל לגבי זיהוי האנטומיה תולעת או ביצוע microinjection. יתר על הקווים מהונדס מרובים מתקבלים בדרך כלל הפגזה אחת. כמו כן, בניגוד microinjection, הפגזה biolistic מייצרת חיות טרנסגניות עם שני מערכים extrachromosomal ו transgenes משולב. היכולת לקבל קווי מהונדס משולב יכול למנוע את השימוש של פרוטוקולים מוטגניות לשלב דנ"א זר. לסיכום, הפגזה biolistic יכולה להיות שיטה אטרקטיבי עבור הדור של חיות טרנסגניות, במיוחד עבור החוקרים לא מעוניין להשקיע את הזמן והמאמץ הדרושים כדי להיות מיומנים microinjection.

Protocol

סקירה

תולעים מהונדס מסורתי נוצרו על ידי microinjecting DNA transgene לתוך C. elegans germline ^1,2,3,4. אמנם מוצלח, גישה זו נדרש ציוד מיוחד ופיתוח ניסיון עם האנטומיה התולעת ואת הטכניקה microinjection. לאחרונה biolistic הפצצה פותחה כגישה חלופית אשר משתמשת DNA מצופה חלקיקי זהב להציג דנ"א זר לתוך ^5,6 germline. גישה זו דורשת השקעה פחות זמן במונחים של תרגול כדי להצליח.

הפגזה biolistic של ג elegans כדי לייצר תולעים מהונדס בעל יעילות נמוכה ברמה של התולעת בודדים כל כך הצלחה דורשת כמות גדולה של בעלי חיים. אלה יכולים להיות מבוגר בכמה דרכים, אבל אנו משתמשים בצלחות ביצה כדי להקטין את העבודה מספר צלחות מעורב. פרוטוקול שלנו מתחיל עם הכנת לוחות ביצה תולעים ואז מתמקד בפרוטוקול הפצצה באמצעות מערכת Bio-Rad PDS-1000/He Hepta. התאמנו פרוטוקול שלנו חלק מהעבודה של Berezikov ואח' ^7.

עם הפגזה, הגן UNC-119 משמש בדרך כלל כסמן חיות טרנסגניות. זנים תולעת זו נושאת מוטציה הם מתואמים קשות ובקושי זז, הם גוצה במראה, ולא מסוגלים ליצור הזחלים dauer ^8. Dauer הוא שלב הזחל חלופי המשמש לעכב פיתוח מבוגר הרבייה בתנאים קשים, ואת כניסתו dauer מוסדר על ידי גנים רבים ^9. זנים אחדים נושאת את הגן UNC-119 זמינים ג elegans גנטיקה מרכז (CGC, מיניאפוליס, מינסוטה). המתח המקורי DP38 (UNC-119 (ed3)) גם נושא מכונן קשור dauer היווצרות (daf-c) מוטציה שעלולות להשפיע על הניסויים במורד הזרם. מעבדות אחדים outcrossed זו מוטציה, והמתח HT1593 זמין CGC. אנו מוצאים כי חיות טרנסגניות שקצת יותר קל יותר להזדהות עם זן DP38 נוטים להשתמש זן ליצירת חיות טרנסגניות. בעת הצורך, אנו משתמשים HT1593 אל שולי ולא את התולעים מהונדס כדי להסיר את המוטציה daf-c. קבלת DP38 תולעים לגדול היא אחד הצעדים האיטי ביותר בפרוטוקול ולכן אנו שומרים על מלאי של לוחות גדל בזמן הכנת transgenes.

הביטוי של סמן UNC-119 יחד עם הגן של עניין מאפשר זיהוי קל של בעלי חיים המבטא את transgene מבוסס על הצלת תנועתיות תקינה גודל הגוף ^5. הגן UNC-119 ניתן להשיג ממספר מקורות, ו וקטורים באמצעות UNC-119-DNA גנומי, UNC-119 האמרגן ו cDNA, ואת ה-DNA הגנומי של ג קטן briggsiae הגן משמשים ^8,10. אנחנו לאחרונה תיאר פרוטוקול פשוט להוסיף קלטת UNC-119 לכל פלסמיד המכיל גן התנגדות אמפיצילין על ידי רקומבינציה הומולוגיים ¹¹ ושיטת לשנות fosmids תולעת לשאת את הגן UNC-119 על ידי רקומבינציה Cre-לקס ליצור חיות טרנסגניות ^12. פלסמידים זמינים Addgene Inc (Cambridge, MA).

למרות המאמץ הכרוך בביצוע הפגזה יחיד הוא משמעותי אבל לניהול, עבודה נוספת מעורב בביצוע הפצצות מרובות ביום אחד היא מינימלית. כתוצאה מכך, אנו שגרתי באשכול הייצור של תולעים מהונדס כדי להקטין את העבודה הכרוכה ביצירת כל אחד.

1. ביצה הכנה פלייט

UNC-119 תולעים מוטציה קשה לגדול בצלחות NGM רגיל כי עם ניידות לקוי שלהם הם נוטים להרעיב על חלקים של צלחת בעוד בחלקים אחרים של הצלחת עדיין מכילים מזון. צלחות ביצה לפתור את הבעיה הזו כמו את השכבה העבה על צלחות אוכל ביצה מאפשר UNC-119 תולעים לזחול יותר בקלות להשתלט על כל צלחת ^7. צלחות הביצה יש גם את היתרון של תמיכה בצמיחה של מספר רב של תולעים כך צלחות פחות נחוצים ^13. בדרך כלל 5 צלחות ביצה מספיקים כדי לגדל תולעים על הפצצה אחד. המתכון למטה עושה בערך 50 צלחות אבל יכול להיות חצוי לעשות פחות אם תרצה בכך.

צלחות ביצה יכול להזדהם בקלות ולכן אנחנו משתמשים בשתי אנטיביוטיקה ותרופות נגד פטריות על הצלחות ורק להשתמש ביצים שנוצרו על ידי טיפול hypochlorite עבור זריעת הצלחות.

יום 1:

1. הכן LB (400 מ"ל) בבקבוק 500ml. החיטוי עבור 20min.
2. יוצקים 50 ~ 10 ס"מ צלחות NGA באמצעות 1 ליטר עם NGA אגר 2%. אנו מוסיפים 10 מ"ל לליטר nystatin וסטרפטומיצין ל 200 מיקרוגרם / mL ^13.
3. לגדול תרבות 40 מ"ל לילה של OP50-1 ב LB עם סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ​​200. זן זה סטרפטומיצין עמידים זמינים CGC.
4. החיטוי בקבוק 500ml עבורלמחרת.

יום 2:

1. חלמוני נפרדת של 10 ביצי תרנגולת לבקבוק סטרילי. אנו משתמשים מפריד חלמון (זמין בחנויות משק בית, כולל יעד). להתגעש.
2. תביאו נפח 400mL עם LB. לנער
3. דגירה ב 60 ° C למשך שעה 1.
4. מצננים לטמפרטורת החדר.
5. הוסף 40mL של OP50-1. לנער
6. הפץ 5-8 מ"ל של תערובת לכל צלחת.
7. אפשר צלחות להתיישב בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

יום 3:

1. בעדינות יוצקים את הנוזל הנותר מן הצלחות. ייבוש עם מכסים על בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

יום 4:

1. שים צלחות לתוך קופסת פלסטיק או שקית בחנות ובבית 4 ° C עד הצורך. הצלחות אלה להיראות אישור לשימוש 1-2 חודשים.

2. מתזמן צלחות ביצה

1. הרחב את DP38 תולעים על 6 צלחות ס"מ NGA ידי הוספת OP50 מרוכז על צלחות רעב לאחרונה. עבור הפגזה אחת, אנחנו משתמשים ~ 6 צלחות קטנות עד 5 צלחות זרע לביצית. עבור הפצצות מרובים, אנו משתמשים בצלחות קטנות במקום 2 צלחות זרע מועשר peptone לפני זריעת הצלחות ביצה.
2. בידוד ביצים מן DP38 תולעים באמצעות שימוש hypochlorite ^13,14. Resuspend את הביצים מאגרים S-basal או M9 סטרילי ^13,14.
3. מוסיפים את הביצים (> 10000 לכל צלחת) למספר מתאים של צלחות ביצה. לגדל את התולעים על צלחות ביצה על 20 מעלות צלזיוס למשך 7-10 ימים לשימוש הפגזה. צלחות יהיה מוכן לשימוש פעם התולעים החלו לנקות את המזון מן הצלחות. הצלחות אלה ממש קשה להרעיב וגדל משכי זמן ישפרו תשואה תולעת.

הפצצה

אנחנו מכינים את מלאי הזהב מראש ולשמור אותו המאוחסן ב 4 ° C לשימוש. נחוץ גם הם ללא רבב והבחין 10 ס"מ צלחות NGA. הלוחות צריכים להיות ללא רבב זרמו היטב מראש מותר יבש ביסודיות כדי להקל על ספיגת הנוזל הוסיף עם התולעים.

ביום של הפצצה, אנחנו לשטוף את התולעים הראשון ואז להתחיל להכין את ה-DNA מצופה חלקיקי זהב. לאחר מכן להוסיף את התולעים על צלחות ללא רבב NGA ולסיים כביסה חלקיקי זהב והעברתם macrocarriers.

חלקיק זהב הכנה:

1. לשקול 60 מ"ג של חלקיקי זהב בתוך שפופרת 1.7mL ומשרים אתנול 70% עבור 15min. ספין בקצרה לזרז את חלקיקי זהב.
2. לשטוף 3 פעמים במים סטריליים ספין בקצרה בכל פעם כדי לאסוף את הזהב.
3. Resuspend הזהב 1mL של גליצרול סטרילי 50%. זהו זהב מניות פתרון חלקיקים יכול להיות מאוחסן במשך חודשים 4 ° C.

Worms:

1. התהלוכה DP38 תולעים את צלחות עם ביצה חיץ S-basal או M9 ולהעבירם שפופרת 50 מ"ל קונית.
2. שמור את הצינורות על הספסל עד תולעים נמצאים בתחתית. ואז לשאוב את המאגר ולהוסיף טרי S-basal או M9. לשטוף 2 או 3 פעמים, עד חיץ ברור יחסית של פסולת. שמור את התולעים בשלב הזה עד ציפוי DNA הושלמה.
3. לשאוב ולהשאיר כ 2-3 מ"ל של תולעים חיץ לכל הפגזה. העברה צלחת 10 ס"מ ללא רבב NGA על הקרח. חשוב למזער את נפח הועבר כמו צלחת NGA יצטרכו להתייבש לחלוטין לפני ההפצצה. הקפידו לכסות את כל פני השטח של צלחת עם התולעים.
4. אפשר צלחת לייבוש על הקרח. הקרח ימנע את התולעים מן clumping בזמן הייבוש.

שלב זה חשוב: הצלחת צריך להיות יבש התולעים מפוזרים באופן שווה על הצלחת NGA. שמירה על תולעים על הקרח מונע מהם לנוע על הצלחת וצבירה לערימות.

ה-DNA הכנה (עבור הפגזה אחת):

1. מערבבים בתוך שפופרת 1.7mL:
   • 50μl חלקיקי זהב. Resuspend ביסודיות לפני שמוסיפים.
   • 50μl דנ"א (10-15ug). אנו רואים הבדל קטן בין ה-DNA מעגלי או ליניארי. בדרך כלל אנו משתמשים Qiagen מחסניות midiprep לטיהור DNA (Qiagen Inc, ולנסיה, CA).
   • 50μl 2.5M CaCl _2. פתרון זה יציב במשך כמה שבועות בטמפרטורת החדר.
   • 20μl 0.1M spermidine.
     
     Spermidine אינה יציבה בתמיסה מימית. אנחנו עושים aliquots spermidine 70μl ולאחסן ב -20 ° C. לאחר מכן, אנו מוסיפים 1mL מים ממש לפני השימוש כדי להשיג פתרון 0.1M. פתרון זה חייב להיות מוכן טרי עבור כל הפגזה.
     
     אנחנו בדרך כלל מערבולת חלקיקי זהב בצינור 1.7mL במהירות נמוכה ולאחר מכן להוסיף את CaCl _2, דנ"א spermidine / dropwise protamine בעוד vortexing. עבור אנשים שיש להם transfected עם סידן פוספט טכניקה זו היא מוכרת.
     
     יש לנו גם השתמשו protamine במקום spermidine עם תוצאות טובות מאוד ^15. אנחנו מכינים פתרון טרי (1mg/mL) במים אותנודואר 50μl במקום 20μl של spermidine. אם נשתמש protamine, אנחנו בדרך כלל דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במקום הצבת על הקרח. Protamine לא צריך להיות כל הזמן קפוא הוא אבקה ולא נוזל.
2. דגירה את התערובת על קרח למשך 30 דקות, ומדי פעם לערבב כדי לשמור על חלקיקי זהב ההשעיה. ואז ספין בקצרה לשאוב supernatant.
3. לשטוף עם אתנול 300μl 70%. ספין בקצרה.
4. לשטוף עם אתנול 100% 1mL. ספין בקצרה.
5. Resuspend באתנול 170μl 100%.

הכנת macrocarriers:

1. לשטוף 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA) 2-propanol. שים אותם על נייר ונותנים להם להתייבש בטמפרטורת החדר.
2. הוסף 20μl של תערובת DNA / זהב במרכז macrocarrier כל אחד. הקפד זכות מערבולת לפני pipetting לשמור על הזהב ההשעיה.
3. בואו אתנול להתאדות.

3. הפצצה

הקפידו לבצע הפגזה ריק לפני הניסוי כדי לשטוף הליום דרך המערכת.

1. הפעל את משאבת ואקום מלכודת קרוב משאבת ואקום. אנו משתמשים במשאבת שמן ללא ואקום.
2. הפעל מיכל הליום. בדוק הלחץ הוא ≥ 2200psi.
3. דיסק קרע רטוב (1,350 psi) ב 2-propanol, הצבת שמירה על כובע עבור hepta מתאם.
4. בורג מתאם למערכת-1000-PDS והדק עם ברגים מומנט המסופקים.
5. מניחים את 7 macrocarriers לתוך מחזיק והמושב אותם עם הכלי מסופקים. ואז לשים מסך לעצור hepta ואת התחתון לבעל. תהפכו את המחזיק מעל מקום על המדף השני מלמעלה. הצד של זהב הבחין macrocarriers חייב להיות כלפי מטה, בשלב זה.
6. יישר את החורים בחלק העליון של בעל macrocarrier עם שקעים של מתאם hepta.
7. מניחים את צלחת NGA מצופה תולעים (את המכסה) על המדף הנמוך ביותר בתא הפצצות.
8. לחלוטין לפתוח את הידית תזרים שער ריק על PDS-1000. לחץ על כפתור VAC מגיע עד תא 26 ב כספית. ואז לעבור להחזיק בעמדה לשמור על ואקום.
9. לחץ והחזק את כפתור האש עד קרעים דיסק. זה יקרה כאשר הלחץ מגיע 1350psi. לפעמים זה לוקח 50-20 שניות להתרחש. שחרר את לחצן.
10. שחרור ואקום מבית הבליעה (עמדה לפרוק), ולהסיר צלחת.
11. הפעל ואקום לסירוגין הליום.
12. אש מספר פעמים, עד הקו אינו מכיל הליום (מד הליום צריך לסמן 0 psi).
13. כבה את מערכת PDS-1000.

תולעת התאוששות אחרי הפצצה:

1. השאירו את הצלחת מופגז על 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
2. Float התולעים מהצלחת עם חיץ מ"ל 10 S-basal או M9.
3. שים תולעים 0.5mL על 20-10 ס"מ הבחין צלחות NGA.
4. השאירו על 20 מעלות צלזיוס בטמפרטורה או חדר (22-24 מעלות צלזיוס) במשך כ 2 שבועות לפני בדיקת תולעים שניצלו.
5. מסך של תולעים עם פנוטיפ UNC-119 (+) עם מיקרוסקופ לנתח. הזמן האופטימלי הוא אחרי ההקרנה הצלחות גוועים ברעב מאז הצילו את התולעים יש יתרון הישרדותי על פני אי - הצילו תולעים.
6. צור שורה אחת בודדת מתוך צלחת 10 ס"מ כל אחד שהכיל תולעים שניצלו.

4. נציג תוצאות

ההצלחה של פרוטוקול לגבי קבלת חיות טרנסגניות תלוי transgene מסוים. עבור היזם: transgenes GFP כתב השגנו עד 20 שורות. תוצאה אופיינית יותר היא 3-10 שורות. עד 30% של קווי מהונדס קווי משולב, אבל זה אקראי ואנו לבצע הפצצות מרובות ביום אחד אם קו משולב רצוי במיוחד.

Discussion

הפגזה Biolistic היא שיטה פשוטה להציג דנ"א זר לתוך אורגניזמים רבים, כולל ג elegans ^1,5,6,7,16. הוא מסתמך על חלקיקי זהב ויצרו מורכבות עם ה-DNA בנוכחות CaCl _2. פוליאמינים קטיוני, כגון spermidine, להגן על ה-DNA מן השפלה nuclease in vivo. מאז spermidine הוא מולקולה יציב, חשוב לאחסן אותו aliquots ק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556