Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

Summary

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Abstract

תרופות רבות מולקולות קטנות אחרות נהגו לווסת את הפונקציה הביולוגית הם amphiphiles כי לספוג בממשק bilayer / הפתרון ובכך לשנות את מאפייני bilayer השומנים. זה חשוב כי חלבונים בממברנה הם מצמידים במרץ bilayer המארח שלהם על ידי אינטראקציות הידרופוביות. שינויים במאפייני bilayer ובכך לשנות את חלבון קרום פונקציה, אשר מספק דרך עקיפה amphiphiles לווסת את תפקוד החלבון ומנגנון אפשרי "מחוץ היעד" השפעות התרופה. פיתחנו בעבר assay אלקטרו לאיתור שינויים במאפייני bilayer השומנים באמצעות ערוצים gramicidin ליניארי כמו בדיקות ^3,12. ערוצי Gramicidin הם מיני חלבונים שהוקמה על ידי dimerization transbilayer של שתי יחידות משנה שאינם מנהלים. הם רגישים לשינויים בסביבה הממברנה שלהם, מה שהופך אותם בדיקות עוצמה עבור ניטור שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש. אנחנו עכשיו להפגין assay הקרינה לאיתור שינויים במאפייני bilayer באמצעות אותם ערוצי בדיקות. Assay מבוססת על מדידת זמן מהלך מרווה פלואורסצנציה מ fluorophore טעון שלפוחית ​​unilamellar גדול בשל כניסתם של מרווה בצינורות gramicidin. אנו משתמשים זוג הקרינה אינדיקטור / מרווה 8-aminonaphthalene-1-,3,6 trisulfonate (נמלים) / טי ⁺ כי שימש בהצלחה אחרות מבחני מרווה פלואורסצנציה ^5,13. טי ⁺ מחלחלת לאט bilayer השומנים ⁸ אך עובר בקלות דרך מנהל ערוצי gramicidin ^1,14. השיטה היא מדרגי מתאים גם מחקרים מכניסטית תפוקה גבוהה ההקרנה של מולקולות קטנות עבור מביך-bilayer, ואת הפוטנציאל "מחוץ היעד", אפקטים. אנו מוצאים כי התוצאות בשיטה זו הן בהסכם טוב עם תוצאות אלקטרו הקודם ^12.

Protocol

1. צור נמלים מלא ליפוזומים

1. ביום 1, להסיר ממס אורגני מן שומנים.
2. הסרת שומנים מהמקפיא ולתת לו לאזן לטמפרטורת החדר.
3. הוסף 0.6 מ"ל של 25 מ"ג / מ"ל ​​(1,2-dierucoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) שומנים בתמיסה כלורופורם כדי בקבוקון 25 מ"ל תחתית עגולה.
4. הרף לסובב את הבקבוק תוך ייבוש תחת חנקן, עד שכל כלורופורם התאדו וסרט לבן דק של מעילים השומנים שכל החלק התחתון של הבקבוק.
5. יבש dessicator תחת ואקום לילה.

1. ביום 2, להכין את המדגם עם fluorophore כי ישולבו שלפוחית.
2. רעננותם מ"מ 100 NANO _3, 25 נמלים מ"מ (Na מלח), 10 HEPES מ"מ. השתמש HNO ₃ או NaOH להתאים את ה-pH 7.0. כל מולקולה נמלים יש 2 ⁺ Na, עבור סכום כולל של 150 מ"מ [Na ^+]. הוספת 1.671 מ"ל של אלקטרוליט לקבל השעיה 10 השומנים מ"מ.
3. Parafilm ו מערבולת ההשעיה ביסודיות.
4. הגן מדגם מן האור עם רדיד ולתת לו גיל בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

1. ביום 3, להפוך את שלפוחית ​​unilamellar גדול להסיר את כל fluorophore מבחוץ שלפוחית.
2. Sonicate דקות 1 ב sonicator צריכת חשמל נמוכה.
3. להקפיא להפשיר מדגם 5-6 פעמים, בכל פעם עם 5 דקות על קרח יבש 5 דקות חם (~ 50 ° C) ומים.
4. Extrude את ההשעיה השומנים באמצעות אוואנטי מיני extruder. הגדרת מיני extruder עם 0.1 מיקרומטר פוליקרבונט לסנן ולסנן תומך (עיין במדריך extruder לפרטים נוספים). Extrude את ההשעיה קדימה ואחורה 21 פעמים כזה ההשעיה בסופו של דבר על מזרק הפוך. כאשר קבוצות מרובות נמתחים, זכור תמיד לטעון דגימות עם מזרק אחד. במהלך שחול ההשעיה מעונן השומנים הראשוני צריך להיות כמעט שקוף (הוא עדיין יהיה צהוב בשל fluorophore הנמלים). אם שחול פתאום הופך להיות יותר קל הלחץ פחות צורך לעבור דרך המסנן, המסנן יכול להיות מקרע ויהיה צריך להיות מוחלף.
5. הסר נמלים חיצוני על ידי הפעלת ההשעיה הנמתח על פני טור PD-10 desalting באמצעות פרוטוקול הכבידה. לאזן טור עם 20-30 מ"ל של Na-חיץ (140 mM NANO _3, 10 HEPES מ"מ, pH 7.0, לזכור להשתמש HNO ₃ או NaOH להתאים את ה-pH). הוסף 1.5 מ"ל של ההשעיה השומנים extruded לעמודה ולתת לו לחלחל פנימה להביא את סך היקף המדגם כדי mL 2.5 ידי הוספת 1 מ"ל Na-חיץ. לאחר חיץ משולב במלואו לתוך הטור ושום דבר לא דולף החוצה, elute ליפוזומים עם 3 מ"ל של Na-חיץ ולאסוף את המדגם שהתקבל. הנמלים וכתוצאה מכך מלא LUV פתרון המניות צריכה להכיל על שומני mM 4-5 מופיעים שקוף לבן חלבי. הגנה על מדגם מן האור עם רדיד.
6. אם הפתרון המניה אינו משמש באופן מיידי, חנות ב 13 ° C לכל היותר 7 ימים. אזהרה: לא להקפיא או לקרר את הפתרון השומנים מתחת לנוזל, הטמפרטורה שלה גביש בשלב המעבר (~ 12 ° C), כמו זה יהרוס את השלמות של שלפוחית ​​ואת fluorophore ידלפו החוצה.

2. מערבבים Fluorescence פתרון

1. 24 שעות לפני השימוש, לדלל ליפוזומים ו דגירה עם gramicidin (ב 13 ° C). איזון של gramicidin בין monolayers הפנימיים והחיצוניים שלפוחית ​​"השומנים היא תהליך איטי, המחייב דגירה ארוכה.
2. מערבולת ביסודיות נמלים מלא LUV פתרון מניות כמו 'לאב' יש צפיפות> 1 גרם / מ"ל ​​ועל כן משקעים בפתרונות.
3. מערבבים את נמלים מלא LUV 1:20 המניות Na-חיץ. מערבבים את כל ליפוזומים לשימוש יום אחד הניסויים יחד בבקבוק אחד כדי לשפר את אחידות המדגם.
4. הפרד את 3 / 4 של ליפוזומים ולהוסיף 260 nM gramicidin מראש מדולל DMSO (500 מיקרוגרם / מ"ל).
5. כדי הנותרים 1 / 4 להוסיף באותו נפח של DMSO (ללא gramicidin) כדי לשמור על ריכוז קבוע ממס כל הדגימות.

3. הגדרת כלי פלואורסצנטי

1. אנו משתמשים יישומי Photophysics SX.20 הפסיקה זרימת spectrofluorometer עם בקרת טמפרטורה למדוד את קצב של מרווה פלואורסצנציה.
2. כבה את המכשירים על שעה לפני הזמן, כדי לאפשר חימום. הרכיבים הם: מחשב יחידה אלקטרוניות לבקרת מים, אמבטיה (שניהם מקרר ותנור חימום), אספקת החשמל המנורה מיכל חנקן.
3. הגדרת התנאים ההקלטה באמצעות תוכנת Pro-SX נתונים.
4. הגדר את עירור monochromator הגל 352 ננומטר רוחב פתחים חריץ עבור עירור עד 1 / 1.
5. השתמש λ = 455 nm גבוהה לעבור סינון כדי להקליט את הפליטה.
6. השתמש "תחזיק לחץ" הגדרה, המאפשר את המכשיר כדי לשמור על לחץ חנקן במהלך ההקלטה, ובכך מונע תנודות בלחץ (וחפצי הקלטה) במהלך אלפיות השנייה הראשונים.
7. הגדרת "טילי "עד 1 s ו" נקודות "אל 5000.
8. השתמש בתיבת לחזור ולהתאים את מספר חזרות, בדרך כלל אנו משתמשים 9 ו - 13 חזרות על חיץ ומפעיל מרווה, בהתאמה.
9. טמפרטורת המים באמבטיה צריך להיות מוגדר 25 ° C: הטמפרטורה צריכה להיות במעקב בתוכנה SX.
10. הגדר את נפח הכונן μL 120, כלומר כל פעם המכשיר פועל מדגם, הוא מתערבב 60 μL מתוך כל אחד משני מזרקים. עם ההגדרה הזו אינסטרומנטלית, נפח μL 120 נותן זמן מת ≈ של 1.2 ms.
11. התאם את מתח גבוה (רווח) על גלאי הקרינה עבור פלט של נמלים, liposome להיות סביב 8. לקבלת תערובת ניסיוני רגיל לזכות צריך להיות 400-420 V. חלק מהתרופות הם פלורסנט, כך הם יכולים להרוות את אותות הקרינה. במקרים אלה, רווח / מתח צריכה להיות ירידה.
12. תמיד לטעון את מדגם ניאון לתוך המזרק שמאל חיץ / מרווה בתוך מזרק הנכון. הקפד מערבולת ביסודיות את כל דגימות המכילה ליפוזומים לפני הטעינה, ולהיות מודעים לכך 'לאב' עם הזמן יהיה להתיישב המזרק.

4. עושה ניסוי

1. הכן מדגם של נמלים טעון 'לאב' עם או ממס או תרכובת, לטעון לתוך spectrofluorometer יחד עם או Na-חיץ או TL-מרווה (50 mM TlNO _3, 94 mM NANO _3, 10 mM HEPES ב-pH 7.0).
2. השתמש ב 1.5 מ"ל מדולל נמלים-LUV פתרון, עם או בלי gramicidin, שהוכן יום קודם לכן.
3. מוסיפים את התרכובת בריכוז הרצוי או ממס עבור פקדי. לשמור על ריכוז ממס על מינימום וקבוע בכל הדגימות. ריכוזים יהיה צריך להיות מותאם עם מתחם כלשהו (לא ידוע) חדש כדי להשיג את הרצוי מנה תגובה מגוון. דגירה של 10 דקות במהירות של 25 ° C בחושך.
4. וורטקס LUV מדגם לטעון לתוך מזרק שמאל. טען את Na-TL-חיץ או מרווה לתוך מזרק הנכון.
5. ביסודיות להסיר בועות אוויר דגימות הן על ידי לחיצה על מזרקים קדימה ואחורה.
6. ודא שני מזרקים נטענים באותה מידה לפני סגירת ברזים. טעינת Unequal תגרום מראש ערבוב של פתרונות לפני שהם מגיעים לתא הקלטה.
7. עבור המדגם הראשון, להקליט את הקרינה עם Na-חיץ, לחזור 4 פעמים, להתאים את מתח גבוה (רווח) לפי הצורך, וחזור 5 פעמים.
8. לקבלת דוגמיות הנותרים, 9 חוזר להקליט עם Na-חיץ.
9. החלף את Na-חיץ עם TL-מרווה ולהקליט 13 חזרות.
10. לשטוף עם מים וממשיכים עם מדגם הבאה. כפי שולטת אנו משתמשים דגימות עם: לא gramicidin עם ממס, לא gramicidin ובריכוז מתחם מקסימלית, עם שני gramicidin ממס.

5. ניתוח נתונים

1. העברת תוצאות למחשב ניתוח. קרא את כל הנתונים לתוך MATLAB לניתוח. עבור כל דגימה, לקרוא למאגר כל וחוזר מרווה, למעט ארבעת הראשונים בכל מקרה, אלו מכילים ממצאים ערבוב. בהנחה נפח כונן של 120 μL זה לוקח קצת פחות מארבע יריות לחלוטין לנקות את התערובת הקודמת צינורות הפסיק-הזרם.
2. חוזר חיץ עבור כל דגימות צריך להיות דומה מאוד. אם יש שינוי משמעותי האות הקרינה, אשר תלויה בריכוז המתחם, ואז את המתחם עצמו עשוי להיות פלורסנט ייתכן שיהיה צורך קודם לחסר זה אות הקרינה נוסף לפני נורמליזציה דגימות.
3. ידנית לעבור עקבות ולהסיר "הרע" חוזר: חוזר ובו קוצים או סטיות exponentiality רב בשל ערבוב חפצים ו / או בועות.
4. נרמל חוזר מרווה לערך החל הממוצע של חוזר חיץ עבור כל דגימה. שלב ממוצעים של כל הדגימות לתוך גרף אחד עבור להדמיה.
5. עקבות מוקלט עם gramicidin לא צריכים להיות דומים להראות כמעט שום מרווה פלואורסצנציה, ייתכן שיש ירידה איטית האות הקרינה בשל דליפה איטית של טי ⁺ דרך bilayer שלפוחית ​​8. אם המדגם עם gramicidin וללא משנה מראה מרווה משמעותי, אז שלפוחית ​​התדרדרו ולא אמור לשמש נוספת. אם דגימות עם gramicidin אבל לא משנה את ההצגה עם מרווה משמעותי, ולאחר מכן צירוף מדאיג bilayer שלפוחית ​​עד כדי כך שזה מאפשר fluorophore או מרווה לחצות את bilayer.
6. אם המתחם משנה bilayer נכסים שומנים בדם, כמו חש ידי ערוצי gramicidin, במהלך הזמן הקרינה יהיה שונה בעליל.
7. עבור כל דגימה, מתוח מעריכי לדוגמא: ⁴⁾ הוא כשיר הראשון 200-100 ms של עקומת מרווה מנורמל את הקרינה של הפרט חוזר ושיעור ⁴מחושב על 2 ms. ממוצעים וסטיות תקן מחושבים למדגם נתון מכל חוזר על הפרט.
8. ולבסוף, לקבוע את השינוי היחסי בקצב להרוות ידי נרמול המדגם לשלוט בזמן הקרוב כי יש gramicidin ולא משנה.

6. נציג תוצאות

איור 1: היסודות של assay להרוות מבוססי פלואורסצנציה לזהות שינויים במאפייני bilayer השומנים למעלה משמאל:. זום על שלפוחית ​​השומנים יחיד עם נמלים פלוס NANO ₃ ​​מבפנים ננו ₃ פלוס TlNO ₃ בחוץ. למעלה מימין: אות הקרינה רשמה משתמש (טופס מלמעלה למטה) נמלים מלא שלפוחיות ללא מרווה, עם מרווה, עם מרווה מראש מסוממים עם gramicidin nM 87, 260 ו - 780. למטה: ייצוג סכמטי של תא הפסיק זרימה ערבוב.

איור 2: צילום מסך מתוך התוכנה SX Pro-Data הממחישות את לוחות שונים הפניה בתיאור ההתקנה הניסוי.

איור 3:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון 'לאב' עם Na-חיץ הראשון ארבע חזרות אינם נכללים תמיד, כפי שהם מכילים חפצים ערבוב. צינור המחבר את מזרקים מדגם לתא ערבוב יש נפח מוגדר, ולכן חוזר על הראשונות ייתן לנו קריאה של מה שהיה בעבר צינורות: מים לחזור על 1 ו 2, שילוב של מים דגימה לחזור 3, בעיקר מדגם עבור 4 לחזור, ופשוט לדוגמה עבור חוזר הנותרים.

איור 4:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון 'לאב' עם Na-חיץ עם TL-מרווה הראשון ארבע חזרות הוסרו שני המצבים. בנוסף, עבור TL-מרווה מדידות, לחזור על 8 יש להסיר בשל חפצים, בועות אוויר סביר ביותר.

. איור 5: השפעת קפסאיצין (שווי) על מהלך הזמן של מרווה נמלים פלואורסצנטי (א) אות הקרינה מנורמל מעל 1 s, נקודות אפורות לציין תוצאות מכל חזרות (n> 5 לכל מצב); הקווים האדומים מציינים את הממוצע של כל חוזר. (ב) הראשון 100 ms, נקודות אפורות לציין נובע לחזור יחיד עבור כל תנאי; הקווים האדומים נמתחים מתאים מעריכי (2-100 ms) לאלה חוזר. הקו הכחול מציין את מנומרות 2 ms סימן, הזמן שבו שיעור מרווה נקבע. בשני A ו-B עקבות העליונה מראה תוצאות בהעדר טי ^+; את שני עקבות להראות תוצאות בהעדר GA, עם טי ⁺ שווי ±; ארבע עקבות להראות תוצאות נמוכות עם 260 nM GA ו טי ^+, שם המספרים מציינים [יתר] ב מיקרומטר. שיעורי מרווה עבור שווי 0, 10, 30 ו - 90 מיקרומטר, כפי שנקבע על ידי בשיעור של מעריכי מתוח, הם 36 ± 6, 69 ± 6, 8 ו - 85 ± 247 ± 27 (ממוצע ± סטיית תקן, n> 8) , בהתאמה.

Discussion

יש לנו הפגינו assay מהיר הקרינה מבוססי לקביעת פוטנציאל bilayer שינוי של תרופות amphiphiles קטנים אחרים. תרכובות לשנות את מאפייני bilayer צפויים לשנות חלבון קרום לתפקד באופן עקיף, ספציפי, אולי תורם "מחוץ היעד" השפעות התרופה. Assay מנצל את כוחו של ערוצי gramicidin כמו בדיקות לשינויים המ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805