בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Summary

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף HH14 ^- שסתום תאים endocardial ו HH25 כרית שסתום תאים mesenchymal.

Abstract

היווצרות לתפקוד תקין של מסתמי הלב העוברי הוא קריטי עבור התקדמות התפתחותית. הלב העוברי מוקדם הוא צינור בצורת U של endocardium מוקף שריר הלב. מפריש שריר הלב לב ג'לי, מטריצה ​​hyaluronan עשיר דביקות, לתוך הצומת העליות והחדרים (AV) ודרכי יצוא (OFT) לומן. בשלב HH14 valvulogenesis מתחיל כאשר תת קבוצה של תאים endocardial לקבל אותות שריר הלב, לעבור endocardial לשינוי mesenchymal (EMT), וכן לפלוש ג'לי לב. בשלב HH25 הכריות valvular הם mesenchymalized לחלוטין, והוא זה mesenchyme שבסופו של דבר יוצר את מנגנון valvular ו במחיצה של הלב. הבנת המנגנונים כי ליזום לווסת את תהליך הבידול EMT ותא חשובים בגלל הקשר שלהם עם מומי לב מולדים חמורים. במחקר זה אנו מציגים שיטות לבודד מראש EMT endocardial ופוסט EMT תאים mesenchymal, אשר הם שני פנוטיפים תאים שונים של כרית prevalvular. Pre-EMT תאים endocardial יכול להיות מתורבת, עם או בלי שריר הלב. Post-EMT תאים AV כרית mesenchymal יכול להיות מתורבת ג'ל קולגן בתוך מוגבל מכנית או ללא מתח. אלה מודלים 3D ב במבחנה לחקות המפתח אירועים morphogenic valvular ו שימושיים לפרק את המנגנונים של valvulogenesis בשלב מוקדם ומאוחר.

Protocol

1. הכנה

1. דגירה שליו פורייה ביצים או עוף לשלב 14 ^- כ (2 ימים) או 25 (כ - 4.5 ימים) ב 60% לחות ו - 37 ° C.
2. הכן תמיסת מלח מאוזן של ארל סטרילי (EBSS)
   1. מוסיפים 100 מ"ל EBSS 10X עד 600 מ"ל מים MΩ 18
   2. הוסף 2.2 גרם נתרן ביקרבונט
   3. התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2
   4. תביא את הפתרון עד 1000 מ"ל
   5. לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר
3. הכן בינוני סטרילי M199 תרבות.
   1. מוסיפים 1 חבילה של אבקת M199 ל 700 מ"ל מים MΩ 18.
   2. הוסף 2.2 גרם נתרן ביקרבונט
   3. התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2.
   4. הוסף 10 מ"ל (1%) פניצילין, סטרפטומיצין
   5. תביא את הפתרון עד 1000 מ"ל
   6. לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר
   7. הוסף 1 מ"ל סטרילי 100x תוספת אינסולין transferrin-סלניום-G
   8. הוסף 10 מ"ל (1%) בסרום עוף סטרילית
4. להכין שלושה ממדי ג'ל קולגן קולגן בריכוז של 1.5 מ"ג / מ"ל. העבודה הקודם במעבדה שלנו הראו כי ריכוז הקולגן של יותר מ 1.5 מ"ג / מ"ל ​​מספקת מטריקס כי היא נוקשה מדי biomechanically עבור התאים כדי לעבור. ריכוזים קולגן ג'ל נמוך יותר מאשר 1.5 מ"ג / מ"ל ​​יש סיבי קולגן אחדים כך גוש תאים יכולים לגרוס את סיבי מקומית, ייצור אי של תאים.
   1. מוסיפים את הבאים קר כקרח ריאגנטים אל צינור מ"ל סטרילי 15 צנטריפוגות כדי:
      • 3X M199: נפח = נפח הכולל הכרחי / 3
      • סטרילי 18 MΩ מים: נפח = נפח הכולל הצורך (M199 נפח נפח עוף + סרום + 0.1 נפח NaOH M + נפח קולגן)
      • סרום עוף סטרילי: נפח = נפח הכולל הכרחי * 0.01
      • זנב עכברוש קולגן אני: נפח = (ג'ל ריכוז הקולגן * סך היקף הצורך) / קולגן ריכוז המניה
      • סטרילי 0.1 M NaOH: נפח = נפח הקולגן * 0.2
        הערה: כמות המים, 0.1 M NaOH, וכן קולגן נוסף ישתנו בהתאם לריכוז פתרון המניות קולגן.
   2. מערבבים את הפתרון קולגן היטב עם פיפטה סטרילית.
   3. מיד להעביר 0.3 מ"ל של התמיסה לתוך קולגן 1.9 ² ס"מ בארות הצמיחה באזור. זהו פתרון קולגן מספיק כדי לכסות לחלוטין את הבאר לספק ג'ל כי הוא כ 3 מ"מ עובי. עובי ג'ל של לפחות 250 מיקרומטר הכרחי ללימודי הפלישה התא.
   4. אפשר פתרון קולגן כדי ג'ל למשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -100% לחות.

2. Pre-EMT Endocardial בידוד תא ותרבות

1. העובר בידוד
   1. מניחים חתיכה אחת ארוכה אינץ של הקלטת מעבדה על קצה הרחבה יותר של הביצה. זה המקום שבו התא נמצא באוויר. הקלטת מייצב את מעטפת הביצית שביר שליו.
   2. בעדינות לנקב את שטח מוקלט של הביצה בתא אוויר עם קצה מעוגל מספריים מעוקרים.
   3. חותכים חור בחלק מוקלטות של הביצה כי הוא גדול מספיק כדי לאפשר החלמון לעבור. התחל את החור ב לנקב את חתך החוצה בצורת ספירלה. הקפד לחתוך דרך הממברנה החיצונית, אך להימנע פירסינג החלמון.
   4. כאשר חור במעטפת תושלם, לדמיין את העובר שליו. העובר נמצא בדרך כלל בצד העליון של החלמון.
   5. בגין לשפוך את החלמון דרך לחתוך את החור הביצה ביד אחת. החזק פינצטה # 55 ב מצד שני. כאשר העובר יוצא ביצה בצד העליון של החלמון, החלק בעדינות את # 55 פינצטה תחת העובר ולהסיר ממנו החלמון. הערה: ביצים, עוף, הבידוד העובר כרוך פיצוח ביצה עוף על משטח, חד ונקי לשבור את הביצה לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. העובר צריך להיות ממוקם בצד העליון של החלמון. החלק בעדינות # 55 פינצטה תחת העובר ולהסיר ממנו החלמון.
   6. מניחים את העובר לתוך צלחת פטרי המכילה 100 מ"מ קר כקרח, EBSS סטרילית.
2. שלב את העוברים על פי הקריטריונים של המבורגר המילטון ^1. עוברים בשלב 14 ^- הם שלב 13 האחרונות, אבל עדיין לא ב 15 הבמה, עם 20-21 somites וניצן הזנב. מאפיין המפתח של שלב 14 ^- עוברים הוא זווית הראש, שהוא קצת יותר מ 90 מעלות לגוף.
3. הסר את לבבות מעוברים שליו בשלב 14 ^- # 55 עם פינצטה ידי קיצוץ רוחבי שבו התעלה AV ו OFT ליצור קשר עם קיר החזה. מניחים את לבבות בצד אחד של צלחת פטרי.
4. אסוף את לבבות בודדים עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ"מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS.
5. חותכים את OFTs ותעלות AV רוחבי מן החדרים עם # 55 פינצטה.
6. סעיף התעלות AV הנותרים ו / או שטחי יצוא (OFTs) longitudinally.
7. הגדר פיפטה לנפח של UL 20. השתמש פיפטה כדי לשאוב six longitudinally לחתוך תעלות AV ו OFTs.
8. לגרש את תעלות AV ו OFTs על ג'ל קולגן. לשאוב כל EBSS עודף מפני השטח של הג'ל.
9. השתמש # 55 פינצטה כדי לכוון את explants ולכן הם שטוחים כך את הצד לומן הפנים ג'ל קולגן. נסו לא לנקב את ג'ל קולגן בפינצטה.
10. לאחר 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2, להסיר את שריר הלב מן explants # 55 עם פינצטה. התאים endocardial צריך להשאיר מאחור על פני השטח של ג'ל קולגן. לחלופין, שריר הלב יכול להיות שמאל על explant. עם הסיר שריר הלב, התאים endocardial עם לא עוברים EMT ללא התערבות. עם שריר הלב הנוכחי תת קבוצה של תאים endocardial יהפוך mesenchyme, אך מידת השינוי יכול להיות מאופנן עם גורמים חיצוניים. הערה: גם אם שריר הלב תישאר על, explant יש לאפשר לפחות 2 שעות לצרף הג'ל לפני המדיום הוא הוסיף.
11. הוסף 0.4 מ"ל M199 בינוני לכל explants היטב המכיל.
12. התרבות התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -100% לחות.

3. Post-EMT AV Cell mesenchymal כריות בידוד ותרבות

1. לפצח את הביצה עוף על משטח, חד ונקי לשבור את הביצה לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. העובר צריך להיות ממוקם בצד העליון של החלמון. תרימי את העובר עם # 5 על ידי פינצטה לתפוס את הקרומים המקיפים את העובר ולאחר מכן למקם את העובר לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ מלאים קר כקרח, EBSS סטרילית.
2. שלב את העוברים על פי הקריטריונים של המבורגר המילטון ^1. תכונות של עובר שלב 25 כולל המרפק ברורים המפרקים בברך פיגמנטציה עין קלה.
3. לבודד את ליבם מכל HH25 עוברים במקום לבבות בצד אחד של צלחת פטרי.
4. אסוף את לבבות בודדים עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ"מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS.
5. לבודד את האזור AV מכל הלב בבת אחת. מניחים את AVS יחד בצד אחד של צלחת פטרי. בעדינות להתסיס את האזור AV להסיר את כל הדם, מה שעלול להשפיע על כדאיות התא.
6. אסוף את AVS מבודד עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי חדש 100 מ"מ מלא סטרילי, קר כקרח EBSS.
7. ברצף לבודד את הכריות של AV. ודא שאין הנוכחית שריר הלב על כריות AV.
8. איסוף הכריות מבודד עם טפטפת העברת סטרילי ולהכניס אותם לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי 15 מ"ל.
9. ספין הכריות לחלק התחתון של הצינור צנטריפוגות ב XG 15 במשך 3 דקות.
10. השתמש טיפ סטרילי 1000 מ"ל כדי להסיר כמה שיותר supernatant EBSS ככל האפשר מבלי להפריע כריות.
11. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA כי כבר מראש לחמם 37 ° C. אפשר הכריות כדי לדגור על טריפסין עד שהם נמס לגמרי, שהיא בדרך כלל כ 3-5 דקות.
12. הוספת 100 μL של נסיוב עוף הצינור צנטריפוגות כדי להרוות את טריפסין.
13. גלולה התאים ב XG 160 במשך 5 דקות. הסר את supernatant עם טיפ, סטרילי μL 1000.
14. Resuspend התאים 2 מ"ל של מדיום M199 ומערבבים ידי pipetting. קח 10 μL ההשעיה התא לסמוך על hemocytometer ולקבוע את המספר הכולל של תאים שהיו מבודדים
15. לקבוע כמה ג'ל קולגן ייעשה על בסיס מספר של תאים בודדים. תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות של 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל עם נפח 250 ג'ל μL.
16. גלולה התאים ב XG 160 במשך 5 דקות. הסר את supernatant עם טיפ, סטרילי μL 1000.
17. באמצעות פרוטוקול המפורטות לעיל, להוסיף 3X M199, מים, עוף בסרום, קולגן, 0.1 M NaOH, בסדר הזה, אל התא גלולה. מערבבים על ידי pipetting עדין.
18. הוספת 250 μL לכל אזור גידול 1.9 ² ס"מ היטב.
19. אפשר פתרון קולגן כדי ג'ל למשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, ו -100% לחות.
20. הוסף 0.4 מ"ל של התקשורת בתרבות דגירה לילה.
21. כדי להמשיך culturing ג'לים מדגישים ללא תנאי, לשחרר את הג'לים מן הצדדים של התרבות גם באמצעות קצה סטרילי 200 פיפטה μL. תרבויות מוגבלים מבחינה מכנית הם ג'לים שנשארים מחוברים הצדדים התרבות היטב.

4. נציג תוצאות

איור 1:. דוגמאות של עוברים (א) HH14-שליו העובר, ו (ב) העובר HH25 עוף מוצגים כאן.

fig2.jpg "alt =" איור 2 "/>
איור 2: HH14 שסתום explants endocardial לאחר 2 שעות של תרבות (A) עם ההווה שריר הלב, או (ב) עם שריר הלב הסיר..

איור 3:. HH14 שסתום explants endocardial (A) עם ההווה שריר הלב, רבים של תאים עוברים endocardial לשינוי mesenchymal ויש להם ציר בצורת, פנוטיפ mesenchymal לאחר 48 שעות של תרבות. (ב) כאשר שריר הלב הוא הסיר כל התאים לשמור המרוצף בצורת, פנוטיפ endocardial לאחר 48 שעות בתרבות.

איור 4:. HH25 תאים תאים שסתום mesenchymal ב ג'ל קולגן מעוגלות מיד לאחר זריעת.

איור 5:. HH25 תאים mesenchymal בתרבות (א) לאחר 48 שעות של תרבות ג'ל קולגן מוגבל HH25 תאים mesenchymal מתחילים להתפשט. (ב) HH25 תאים בג'ל ללא מתח קולגן 7 ימים לאחר זריעה ו 6 ימים אחרי השחרור יש לדחוס את הג'ל על כ -50% של האזור המקורי.

Discussion

השיטה לבודד תאים endocardial משלב HH14 ^- לבבות שפותח במקור על ידי ראניין ו Markwald מספק מבוקרת, בסביבה מבחנה כדי לחקור את הגורמים ליזום לווסת EMT עובריים ^2. HH14 ^- explants endocardial תרבותי ללא שריר הלב לא יעברו EMT ללא התערבות ביומכנית או ביוכימי. אם שריר הלב נשאר ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5	World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S
4-well culture plates	Nalge Nunc international	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane	Nalge Nunc international	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm	VWR international	25384-342
Laboratory tape	VWR international	89097-920
Rat-tail collagen I	BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution	Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder	Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)	Invitrogen	41400-045
Chicken serum	Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)	Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)	Cornell University Poultry Farm