מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

Summary

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

Abstract

מודל זה הניסוי תוכנן לאמוד את microcirculation עכבר pial במהלך hemodynamic, אקוטי וכרוני פיזיולוגיים pathophysiological, התנאים דלקתיות מטבולית, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב vivo. חלון סגור גולגולתי ממוקמת מעל קליפת parieto-העורפית השמאלית של העכברים. Microcirculation מקומי נרשם בזמן אמת דרך החלון באמצעות EPI ו תאורה פלואורסצנטי, מדידות של קטרים ​​כלי שיט תא הדם האדומים (RBC) מהירויות מבוצעות. מהירות RBC נמדד בזמן אמת צולבות מתאם ו / או אריתרוציטים ניאון שכותרתו. דבקות ליקוציט ואת טסיות לכלי pial והערכה של זלוף ו דליפה של כלי הדם נעשים בעזרת סמנים פלואורסצנציה שכותרתו כגון אלבומין-FITC נוגדנים אנטי-CD45 TxR. Microcirculation ניתן וידאו מוקלט שוב ​​ושוב על פני כמה ימים. השתמשנו בפעם הראשונה את החלון קרוב המוח מיקרוסקופיה intravital ללמוד את microcirculation pial לעקוב אחרי שינויים דינמיים במהלך זיהום Plasmodium אנקה berghei בעכברים מראים ביטוי של CM קשורה בתפקוד microcirculatory מאופיין vasoconstriction, הירידה העמוקה בדם זרימת הדם ובסופו של דבר לקרוס.

Protocol

1. Craniotomy

Craniotomy ב 8 ל-10-שבוע בעכברים הישנים יש לבצע מראש כמו ¹ שתואר לעיל, פרט לכך בר טיטניום אינו ממוקם בראש של החיה. חלון גולגולתי כרוני הוא יציב ומאפשר בדיקה הכנה של microcirculation pial אפילו חודשים לאחר השתלה. בדרך כלל, אנו מבצעים מחקרים שלנו 2-3 שבועות לאחר ההשתלה את החלון גולגולתי.

2. Intravital מיקרוסקופיה

1. שני שלושה שבועות לאחר craniotomy, טמפרטורת הגוף מסומנת ולאחר מכן העכבר הוא הרדים קלות isoflurane (4% לזירוז,% 1-2 לצורך תחזוקה). הרדמה אור משמש כדי למנוע מתח חיה ואי נוחות במהלך ההליך הניסיוני.
2. בעלי חיים ממוקמות אז על מסגרת stereotaxic וראש מאובטח בקפידה באמצעות מוטות אוזן בעמדת מועדים. רמת מותאם באמצעות מנופים על ימין ועל שמאל. טמפרטורת הגוף Core נשמר באמצעות כרית חימום. כי עכברים עם מלריה מוחית לפתח היפותרמיה, את הגדרות הטמפרטורה צריך להיות מותאם עבור כל חיה.
3. להחליק לכסות על חלון גולגולתי הוא ניקה בעדינות עם ספוגית צמר גפן טבולה שמן מינרלי תמונה פנורמית של כלי מתחת לחלון נלקחת בעזרת stereomicroscope לבין מצלמה דיגיטלית (Nikon Coolpix 995, יפן). התמונה מודפסת, המזוהה ומתוארך וישמש כמפה עבור מדידות של קוטר כלי ו כדוריות דם אדומות (RBC) מהירויות.
4. העכבר הוא הועבר לאחר מכן בשלב מיקרוסקופ intravital (אישית לייקה-McBain, סן דייגו, קליפורניה). טיפת מים מונחת על החלון גולגולתי מנצל את יצרו גם אקריליק על ידי השיניים, להתמקד מותאם. המדידות מתבצעות באמצעות טבילה 20X (LUMPFL-לאגודה, מספרי הצמצם 0.6, אולימפוס) המטרה מים. הכלים אותם הם בעקבות כך השוואה ישירה לרמות הבסיס שלהם ניתן לבצעו המאפשר סטטיסטיקה יציב יותר עבור אוכלוסיות מדגם קטן. תמונות נלכדים באמצעות אור דיגיטלי נמוך במהירות גבוהה המצלמה (C9300 Hamamatsu-221, יפן), או אור נמוך מצלמה אנלוגית (COHU 4815, בסן דייגו, קליפורניה) קשור לקלטת וידאו (JVC, יפן), חותמת זמן (וידאו MicroImage מערכות, Boyertown, PA) וצג צבע (PELCO, קלוביס, CA). הקלטת מזוהה כראוי לפני תחילת ההקלטה, ואת חותמת הזמן מאפשר זיהוי של האירועים על ידי המתעדים את הזמן שבמהלכו אירועים כאלה היו recoded.
5. המחאה הראשונה של כלי נעשית על מנת להעריך את איכות של התכשיר ואם הדם זורם בתוך כלי כל. ואז, מבחר של כלי למדוד מורכב וזה צריך לכלול venules ו arterioles של קטרים ​​שונים (בהכנות עכבר pial שלנו, רוב כלי בטווח בין 20 ל 80μm) ומכסים במקומות שונים בשטח חשוף ליד החלון. Arterioles ו venules ניתן להבדיל בקלות על ידי בדיקת כיוון זרימת הדם ההשלכות של כלי השיט (אם זה מפיץ או אוסף דם). במחקרים שלנו, מדידות נעשות 12 כלי שיט. המיקום המדויק של כל נקודה כדי להימדד הוא המבואר בתמונה של vasculature pial.
6. עבור כל נקודה, קוטר כלי נמדד באמצעות מכשיר גזירה התמונה (לגזור תמונה, Vista אלקטרוניקה, בסן דייגו, קליפורניה) ^2. לאחר נקודה זו מסומנת, תמונה של כלי מיושר במצב אנכי ואת התמונה הוא טעון עד הקצוות בניגוד מיושרים והקריאה מתועדת. ערך זה יכול להיתרגם מיקרומטר ידי כיול הקודם עבור כל הגדלה מסוימת באמצעות כיול reticle שלב מיקרומטר (אדמונד Optics Inc, ברינגטון, NJ).
7. במקום כל שנרשמו במהלך 30 שניות לפחות למעקב כדורית אדומה. במשך המעקב, דגימת דם נאסף ו אריתרוציטים מסומנים fluorescently עם carbocyanine לצבוע דיל (בדיקות מולקולריות, Carlsbad, CA) ואת חדורים דרך וריד הזנב להשיג ריכוז vivo של 0.4-0.5% ~ ^3. אצל בעלי חיים נגועים Plasmodium berghei אנקה (PBA) המבטאים את חלבון הפלואורסצנט הירוק (PBA-GFP, תרומה מן המחקר מלריה מגיב הפניה מרכז MR4, Manassas, VA, שהופקד על ידי CJ Janse ו AP ווטרס), לא עירוי של תווית התא הוא הכרחי. התמונות וידאו נרשמות 150 מסגרות לשנייה. שיעור זה מוגדר להשיג 05:59 תמונות של תא על מסגרת וידאו אחד לקביעת מהירויות של עד 8 מ"מ / s. תמונות וידאו דיגיטלית עם מחשב אישי באמצעות תוכנת Adobe Premier 4.0, ו - xy נתונים לתאם עבור כל תמונה התא מתקבלים באמצעות SigmaScan Pro 4.0 התוכנה (SPSS שיקגו, אילינוי) ^4. עמדות Cell נקבעים באופן ידני ולא על ידי ניתוח התמונה, בהתחשב בכך את עינו של הצופה מיומן הוצגה לתת הערכה טובה של מיקום מרכז התא, אשרח בכלל מתאים למיקום של הקרינה המרבית נצפתה עבור אוריינטציות תא ביותר. קביעות מרובות של המיקום ואת המהירות מיוצרים עבור כל תא ממוצעים להשיג ממוצע מהירות RBC.
8. כאשר המדידות RBC מהירות מבוצעות מקוון, זמן תצפית סך כל עכבר אינו עולה על 10-15 דקות מזעור ההשפעות cardiodepressive של הרדמה.
9. לאחר קוטר כלי מדידות מהירות RBC זמינים, החישוב של זרימת הדם בכלי זה יכול להתבצע באמצעות הנוסחה: Q = V x π (D / ²⁾ 2, שם ש = זרימת הדם, V = מהירות RBC ו-D = קוטר כלי הדם.
10. נהלים אלה ניתן לחזור לאורך זמן. לדוגמה, במודל עכבר של קדחת המוח, אנו מבצעים מדידות יומי החל ביום 4 של זיהום. הערכים המתקבלים כל יום במשך כל עכבר מנורמל הן ביחס ליום 0 (טרום זיהום), אשר נחשב 100%.
11. בנוסף קוטר כלי הדם וזרימת מדידות, הערכות נוספות יכול להתבצע, למשל הערכה משופרת של זלוף ועל ניתוח של גלגול ליקוציט ו / או טסיות דם דבקות בכלי pial. מדידות אלה מבוצעות בעזרת סמנים ניאון שכותרתו. במקרה של מלריה, אנו יכולים גם לזהות במחזור או טפילים חסיד באמצעות שימוש זן PBA המבטא GFP.
12. להערכת זלוף אנו משתמשים בפתרון של FITC שכותרתו אלבומין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי 50μg/mouse), וכן לכמת דבקות ליקוציט לכלי pial אנו משתמשים נוגדנים כנגד סמן הפאן ליקוציט CD45 שכותרתו עם טקסס אדום (TxR) ( Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה 4μg/mouse). לשם כך, 25μL של אלבומין-FITC (2mg/mL) ו 20μL של נוגדנים נגד CD45-PE (200μg/mL) מעורבבים והזריקו ברוח טרום חימם את הזנב. עכבר אז יכול להיות צילמו מיד, אולם אם מדידות זליגה ייקח אלבומין-FITC מותר להסתובב במשך 15 דקות. פלואורסצנטי ירוק (518nm) הנפלטת אלבומין-FITC ו-GFP (PBA-GFP pRBC) הוא שנתפסו באמצעות אלפא ו Vivid: XF100-2 (אומגה אופטי, Brattleboro, VT), אנטי-CD45 TxR פלואורסצנטי (615nm) הוא יצא ו שנתפסו עם תקן Vivid: XF42.
13. ניאון שכותרתו אלבומין מאפשרת הדמיה משופרת של רשת כלי הדם, כולל כלי חודר, והיא שימושית במיוחד במצבי מחלה כמו מלריה מוחית כדי לבדוק את כלי הלא perfused או מתחת perfused. זה יכול לשמש גם כדי למדוד את זליגת הדם ^5.
14. ניאון שכותרתו אנטי CD45 נוגדנים לעשות את זה קל לזהות ולכמת מתגלגל הידבקות לויקוציטים וכן כלי pial. כדי למנוע הטיה כימות, אנו לכמת מתגלגלת הידבקות באותם המקומות שהוגדרו מראש כדי למדוד את זרימת הדם. כימות של הידבקות לויקוציטים נעשית על ידי ספירת לויקוציטים באורך 100μm-כלי. רולינג היא לכמת ידי ספירת לויקוציטים נע במהירות איטית יותר באופן משמעותי את מהירות דם באורך 100μm זאת, במהלך 30 שניות.

3. נציג תוצאות

באיור 1. (שלב 2.6) תמונות של רשת כלי הדם עכבר pial נגיש דרך החלון גולגולתי.

איור 2. (שלבים 3.1-3.5) סכמטי התצוגה של הגדרת עבור מיקרוסקופיה intravital של microcirculation העכבר pial. 1: מיקרוסקופ intravital; 2: 20X טבילה במים אובייקטיבי; 3: מקור אור, 4a: דיגיטלי נמוך לאור מהירות גבוהה המצלמה; 4b: מצלמה אנלוגית: 5: עכבר במסגרת stereotaxic; 6: צג המחשב; 7: אנלוגי שירר צג מראה כיצד הגז תמונה (חץ) נעשה כדי למדוד קוטר כלי הדם.

איור 3. (שלב 3.6-3.8) כלי הדם כדוריות דם אדומות מהירות מדידות על ידי מעקב התא גבוה הקלטות מהירות הקרינה וידאו. תמונות ל-F הם תמונות ברצף של כלי one pial, מראה RBC נע אחד חוצה את התחום בשדה מיקרוסקופי על ידי המצלמה. קביעה ידנית של מסגרת על ידי עמדות מסגרת של 15 תאים או יותר חוצה את השדה, עם המרחק מראש מכויל שלה, המאפשר חישוב מהירות RBC אומר בכלי זה בעזרת גיליון אלקטרוני של Excel.

איור 4. (שלב 3.9) נתוני הניסוי נציג מראה את השינויים בזרימת הדם pial לאורך זמן Plasmodium berghei אנקה (PBA) עכברים נגועים (n = 5) ו בעכברים השליטה נגוע (n = 5). בעוד עכברים לשלוט על זרימת הדם pial יציב יחסית לאורך זמן, PBA נגועים עכברים להראות ירידה ניכרת בזרימת הדםבזמן התפתחות מלריה מוחית (יום 6). הנתונים הם ממוצע ± SEM.

איור 5. (שלב 4.3) מספר רב של לויקוציטים חסיד לכלי pial של עכבר נגוע Plasmodium berghei אנקה, כפי שעולה מכתים עם אנטי-CD45 טקסס נוגדנים אדום ניאון.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מיקרוסקופיה intravital מספק כלי ייחודי ורב עוצמה להתבוננות מפורטת של microcirculation pial בתוך העכבר. זה מאפשר בידודם arterioles הפרט venules ומדידת שינויים של מספר פרמטרים כגון קוטר כלי, מהירויות RBC, זרימת הדם, היצמדות וגלגול של לויקוציטים, טסיות הדם וגורמים אחרים, דליפת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Carbocyanine dye Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumin-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anti-CD45-TxR Ab	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865