Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

Summary

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Abstract

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Protocol

הכנה מראש של microinjection

1. להאכיל יתושים דם: להזרקה מיום שני עד יום שישי נקבות להאכיל ביום חמישי הקודם.
2. הכן מחטים זכוכית באמצעות תוכנית 3 או 2 (ראה חומרים).
3. הנחת צינור עבור עוברי הוא בקבוקון תסיסנית תרבות. צמר גפן רטוב בתחתית, עם דיסק רטוב נייר לסנן מכסה אותו.
4. הכן להחליק כיסוי הפלסטיק על ידי דבק פעמיים בצד קלטת בקצה אחד. קלטת Trim כדי לכסות להחליק כך מסתיים בקצה של פליטת לכסות.
5. הכנת שמן התייבשות (ראה חומרים)
6. 150 מ"ל כוס פלסטיק עם צמר גפן רטוב בתחתית, מכוסה דיסק רטוב של נייר סינון (80mm Whatman) כדי לשמור על העוברים לאחר ההזרקה.

הגדרת הנחת בכפייה

1. איסוף דם 6-10 נקבות נמאס עם השימוש aspirator ולהעבירם בקבוקון התרבות תסיסנית עם צמר גפן רטוב נייר הסינון.
2. שים את היתושים בחזרה התנאים insectory בחושך, ולאפשר להטיל ביצים במשך 1h ו 15 דקות.
3. בואו מבוגרים לטוס לתוך הכלוב ולהוציא את הדיסק עם נייר סינון עוברים.
4. בשורה ביצים, לעשות זאת תחת היקף הניתוחים. בעזרת מלקחיים קנס מס '5 או במכחול דק, לבחור אפור כהה, אפור עוברים לסדר בשורה על ריבוע נייר Whatman 3mm ספוגה מים. עוברים כל חייב להיות בכיוון זהה, כמו הזרקת חייב להיות בקוטב האחורי. סוף הקדמי של העובר הוא מעט רחב יותר מאשר האחורי. יבש את נייר הסינון עם העוברים על ידי לחיצה על מסנן נייר יבש אליו (דברים רטוב לא מקל על קלטת). כדי להעביר את הביצים, להפוך את השקופית המכילה את הקלטת דו צדדית ולחץ בעדינות על הביצים. סוף האחורי של הביצים חייב להיות קרוב מאוד לקצה של הקלטת דו צדדי.
5. ליבש את העוברים על דקות 1. בטמפרטורת החדר. הם מתחילים גומה מעט כאשר הם יבשים.
6. כיסוי עוברים מיובש עם שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת.

Microinjection של העוברים

1. ההיבט החשוב ביותר של זריקה טובה הוא איכות המחט (ראה חומרים).
2. מלא מחט עם פתרון ה-DNA להיות מוזרק באמצעות microloader. פתרון מאוד הזרקה קטן יש צורך: 1 עד 2 μl.
3. חבר את המחט Transjector, אשר שולט על זמן ההזרקה (מנו) והלחץ (600), ואת backpressure (250). Microinjection מבוצע באמצעות מיקרוסקופ עם הבמה נע (לייקה) בהגדלה של 10 x ו micromanipulator. במידת הצורך, לשלב מיקרוסקופ העלה ניתן להכין על ידי הערמה שקופיות מיקרוסקופ 4-5. מניחים את תלוש לכסות נושאת את העוברים על הבמה המוגבהת. הזרק עוברים אופקית כדי למנוע קריעה של endochorion; חדירה צריך להיות בקוטב האחורי. עבור זריקה, אני ממשיך המחט נייחים להזיז את הבמה של המיקרוסקופ.
4. להזריק 0.2-0.5 nl של פתרון, המתאים כ 1-5% מנפח העובר. הפיקוח על נפח הזרקה ידי התאמת הלחץ הזרקה וזמן. קד קלות, עוברים מיובש צריך להחזיר בעקבות הזרקת העכור המראה שלהם.
5. פיק עוברים מן להחליק את מכסה באמצעות מלקחיים קנס או במכחול דק, ומניחים אותם בכוס פלסטיק עם צמר גפן רטוב נייר הסינון הרטוב. מכסים עם כוס נייר. שמור במקום עם הגומייה סביב שולי ולחזור insectary תנאי למשך 4 ימים.

לאחר ההזרקה

1. ארבעה ימים אחרי, עובר הנייר בזהירות מקום, העובר בצד למטה, על פני המים בקופסת פלסטיק גדולה עם כמות קטנה של אוכל. העוברים בוקעים במשך תקופה ארוכה מאוד: לא לזרוק את התרבות עד לפחות 4-5 שבועות לאחר ההזרקה.

הערות

ה-DNA להזרקה

פתרון ה-DNA פלסמיד להזרקה היה מבודד באמצעות ערכת פלסמיד EndoFree. Construct ומערבבים Helper פלסמיד יחד בריכוז הנכון, זירז עם izopropanol. גלולה נשטף עם אתנול 70% לפני resuspending במאגר ההזרקה. לפני הזריקה, DNA נקי באמצעות Millex-GV העמודה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Injection solution	Buffer			5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid	DNA			0.5 mg/ml.
Helper plasmid	DNA			0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit	Kit	Qiagen
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	To clean DNA.
Glass puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-87	Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	Model P-2000	Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles				Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti	Animal			Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial				For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil	Reagent			Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5	Tool
Fine paintbrush		Kolinsky Sable	No. 0000
Whatman paper	Tool
Microloader	Tool	Eppendorf	5242 956.003
Transjector	Tool	Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape