יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

Summary

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

Abstract

האדם hematopoietic גזע / ובתאים מתקבלים בדרך כלל ממח העצם, דם טבורי, או דם היקפיים משמשים ללמוד hematopoiesis ו leukemogenesis. יש להם את היכולת להתמיין שושלות הלימפה ואת מיאלואידית. המושבה להרכיב (CFC) assay תא משמש כדי ללמוד את התרבות ואת דפוס הבידול של אבות hematopoietic על ידי היכולת שלהם ליצור מושבות בתווך מוצק למחצה. המספר את המורפולוגיה של המושבות הוקמה על ידי מספר קבוע של תאים קלט לספק מידע ראשוני על היכולת של אבות להבדיל מתרבים. תאים ניתן לקצור ממושבות הפרט או מהצלחת כולו להמשיך להעריך את מספרם ומדינות בידול באמצעות זרימת cytometry והערכה מורפולוגיים של Giemsa מוכתם שקופיות. Assay זה שימושי להערכת בידול מיאלואידית אך לא הלימפה. מיאלואידית המונח בהקשר זה משמש במובן הרחב שלה כדי להקיף שושלות granulocytic, monocytic, erythroid ו megakaryocytic.

השתמשנו זה assay כדי להעריך את ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות של תאים אנושיים העיקרי CD34 + שמקורם דם היקפי. בשביל זה התאים למטרה הם transduced עם לבנות או לשלוט retroviral או לבנות ביטוי oncogene של עניין, במקרה זה NUP98-HOXA9. אנו מעסיקים וקטור retroviral נפוץ, MSCV-IRES-GFP, אשר מבטאת mRNA bicistronic שמייצר הגן של עניין סמן ה-GFP. תאים מופעלות מראש על ידי גידול בנוכחות ציטוקינים יומיים לפני התמרה retroviral. אחרי עוד יומיים, GFP + תאים מבודדים ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) ומעורבבים עם המדיום methylcellulose המכילים מוצק למחצה בתוספת ציטוקינים מודגרות עד מושבות להופיע על פני השטח, בדרך כלל על 14 ימים. מספר ומורפולוגיה של המושבות מתועדים. תאים יוסרו אז מן הלוחות, שטף, נספר, והוא נתון cytometry זרימה ובדיקה מורפולוגיים. Cytometry זרימה עם נוגדנים ספציפיים על פני התא סמנים הביע במהלך hematopoiesis מספק מידע על השושלת שלב ההבשלה. מחקרים מורפולוגי של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ לאחר מכתים רייט Giemsa לספק מידע נוסף לגבי השושלת והתבגרות. השוואה בין תאים transduced עם בקרת וקטור ריק לאלה transduced עם oncogene מגלה את ההשפעות של oncogene על בידול hematopoietic.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים

1. הכן סטרילי פתרונות מניות 1000x של קינאז FMS הקשורות טירוזין 3 (FLT-3), ליגנד granulocyte / macrophage המושבה גורם מגרה (GM-CSF), תא גזע גורם (SCF), thrombopoietin (TPO), אינטרלוקין (IL) -3 , ו - IL-6 בהתאם להוראות היצרן. הכן Retronectin סטרילי מניות פתרון (1mg/ml) גם על פי הוראות היצרן. מחלקים את הפתרונות הללו לתוך המניה aliquots קטן ולשמור על -20 ° C כדי למנוע חזר להקפיא להפשיר.
2. הכן FBS 2% IMDM.
3. הכן בינוני IMDM להשלים עם ריכוזים הסופי של FBS 20%, 2 גלוטמין מ"מ, 100 יחידות / מ"ל ​​פניצילין / סטרפטומיצין (PS). מוסיפים את ציטוקינים הבאים רק לפני השימוש: 100 ng / ml FLT-3 ליגנד, 20 ng / ml GM-CSF, 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml TPO, 50 ng / ml IL-3, ו - 100 ng / ml IL-6.
4. הכן BSA 1% HBSS (Ca & Mg חינם, ללא פנול אדום) ו BSA 2% ב D-PBS (Ca & Mg-free). לעקר את הפתרונות על ידי עובר דרך מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
5. הכן EDTA 0.02% ב HBSS ולאחסן ב 4 ° C.
6. הכן GaLV-pseudotyped רטרווירוס קידוד ה-DNA של עניין חנות aliquots ב -80 ° C. הליך זה מחוץ להיקף של מאמר זה, אבל מתואר במקומות אחרים (1-3).

עבור מכתים Giemsa

7. רק לפני השימוש, לסנן את הפתרון רייט / Giemsa כתם פעמיים עד 1 מיקרומטר ניירות לסנן לתוך בקבוק זכוכית נקי.
8. מיד לפני השימוש, להכין רייט / Giemsa חיץ pH 6.4, על ידי ערבוב 50 מ"ל של התמיסה רייט / Giemsa מסוננים הכתם 200 מ"ל של תמיסת פוספט חיץ, pH 6.4 - ג'ורדנו הנוסחה.
9. הכן חיץ פוספט פתרון, 6.0 pH ידי המסת 27.3 גרם של KH ₂ PO ₄ ו - 4.62 גרם של Na ₂ HPO ₄ ב 3.5 LH ₂ O.
10. הכן מתנול 50% H ₂ O.

2. נוהל

הפשרה מראש ההפעלה של CD34 + תאים

1. הפשירי בקבוקון של CD34 תאים קפואים + במהירות 37 ° C על ידי רועדות בעדינות עד גביש קרח קטן האחרון שנותר ולהעביר את ההשעיה התא (1 מ"ל) על צינור חרוטי 50 מ"ל. בעדינות ולשטוף את התאים הנותרים מבקבוקון עם 1 מ"ל של בטמפרטורת החדר 2% FBS / IMDM ולהוסיף אותו טיפה חכם שפופרת 50 מ"ל בזמן מסתחררים בעדינות. המתן 3 דקות. לאחר מכן, לאט להוסיף 2 מ"ל של 2% FBS / IMDM, תוך ערבוב בעדינות, להמתין 3 דקות. חזור על נוהל על ידי הוספת 2% FBS / IMDM כי הוא נפח זהה ההשעיה תא מדולל ב 3 דקות במרווחים, מסתחררים בעדינות בין תוספות, עד נפח הסופי מגיע 32 מ"ל.
2. צנטריפוגה XG ב 250 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להסיר את supernatant והותיר אחריו סביב 0.5 מ"ל.
3. שטפו את הכדור על ידי השעיית ב 20 מ"ל 2% FBS / IMDM ו centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הסר את supernatant ו להשעות את התאים בינוני IMDM להשלים בכ 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. קח 10 μl של השעיה התא לתוך תערובת microtube, עם נפח זהה של תמיסת Trypan כחול (0.4%) ולספור באמצעות hemocytometer.
5. לדלל את התאים 0.1-0.15 X 10 ⁶ תאים / מ"ל ידי הוספת בינוני IMDM מלא בתוספת ציטוקינים (ראה 1.3)
6. התרבות התאים humidified 37 ° C חממה עם 5% CO ₂ על 2 ימים.

התמרה retroviral ידי וירוס לפני טעינת

7. ביום התמרה, לספור תאים לפני תחילת וירוס וטעינה מוקדמת כדי לקבוע את מספר בארות להיות מוכנים.
8. פתרון לדלל את המניות Retronectin עד 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולהוסיף 400 μl היטב בכל צלחת 24 גם ללא טיפול בתרבית רקמה. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר בשכונה biosafety זרימה למינרית המעיל מראש.
9. הסר את הפתרון Retronectin ולהוסיף 400 μl של BSA 2% ב D-PBS היטב כל אחד. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
10. הפשירי מניות פתרונות וירוס ולשמור על הקרח. הסר את הפתרון BSA, להוסיף 0.5 מ"ל של הכנת נגיף זה טוב, צנטריפוגה XG ב 2200 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
11. הסר את הפתרון וירוס מבארות וחזור על טעינת וירוס המתואר 2.10 שלוש פעמים נוספות.
12. יש לשטוף היטב עם כל הקור 0.5 מ"ל HBSS (+ Ca & מ"ג) או IMDM.
13. לאסוף את טרום מופעל CD34 + תאים על ידי centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר.
14. Resuspend התאים ב 0.1-0.15 x 10 ⁶ תאים ל 1.5 מ"ל במדיום IMDM להשלים עם ציטוקינים.
15. הוסף 1.5 מ"ל תא השעיה זה היטב מדגירים את humidified 37 ° C חממה עם 5% CO ₂ על 2 ימים.

מיון תאים אוסף של תאים transduced

16. בעדינות אך ביסודיות להשעות את התאים הנ"ל וירוס טעון צלחתs ולסנן דרך פילטר CellTrics 50 מיקרומטר התא לתוך צינור חרוטי. קח 10 μl של השעיה התא לתוך תערובת microtube, עם נפח שווה של פתרון כחול Trypan ולספור באמצעות hemocytometer. יש לשטוף היטב עם כל מ"ל 0.8 הקור 0.02% EDTA / HBSS (Ca & Mg-free ללא פנול אדום) ולהוסיף הצינור אוסף אותו דרך פילטר CellTrics 50 מיקרומטר התא.
17. צנטריפוגה התאים ב XG 200 עבור 8 דקות 4 ° C, ולשטוף את הכדור עם קר HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום) על ידי centrifuging ב XG 200 עבור 8 דקות 4 ° C.
18. Resuspend גלולה 1% BSA / HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום) ריכוז של 15 מ"ל X 10 / ⁶ או אמצעי אחסון מינימלי של 0.250 מ"ל למיון התא. שמור את התאים על הקרח בחושך. הכן צינורית המכילה קר 20% FBS / IMDM / גלוטמין / PS בינוני לאיסוף תאים ממוינים. המיון מתבצע על Core סדרן מהירות גבוהה נייד של ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה באמצעות סדרן במהירות גבוהה MoFlo (Dako, Glostrup, דנמרק).

CFC assay

19. להפשיר את המספר הנדרש של 3 aliquots מ"ל של התקשורת CFC assay. וורטקס במרץ לערבב ולהניח צינורות לעמוד לפחות 5 דקות כדי לאפשר בועות כל ההווה לעלות אל פני השטח לפני הוספת תאים.
20. כדי להשיג את הריכוז תא למדגם כל מיון, מחלקים את מספר הסלולרי שמספק מתקן מיון לפי נפח תא משוער ההשעיה. קח 3,000 וירוסים transduced, תאים ממוינים לתוך microtube סטרילי קר המכיל 2% FBS / IMDM. טרום לכוונן את עוצמת הקול של 2% FBS / IMDM כך נפח ההשעיה הסופי יהיה כ 0.3 מ"ל.
21. להשעות את התאים להעביר את התא כולו ההשעיה 0.3 מ"ל ל aliquot 3 מ"ל של Methocult GF + H4435, אשר מורכב methylcellulose 1%, 30% FBS, BSA 1%, 10 מ ^-4 2 mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 ng / ml SCF, 20 ng / ml GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml-G-CSF, ו -3 יחידות / מ"ל ​​IMDM אריתרופויאטין. האדם Methylcellulose מועשר מדיה (מו"פ Systems) אשר מורכב methylcellulose 1.3%, FBS 25%, BSA 1%, 5 x 10 ^-5 M 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 ng / ml SCF, 20 ng / מ"ל GM-CSF, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, 20 ng / ml-G-CSF, ו -3 יחידות / מ"ל ​​אריתרופויאטין IMDM יכול לשמש גם.
22. וורטקס במרץ כדי להפוך את עליית התערובת באופן מלא ליפול 3-4 פעמים. בואו הצינור עומד עדיין על 3 דקות.
23. צרף 16 מד בוטה קצה המחט מזרק 3 מ"ל ותנסחו 2.2 מ"ל. אין להכין בועות גדולות; לגרש אותם בתחילת לדחוף החוצה על ידי כמה פעמים. דחוף החוצה 1.1 מ"ל כל מנה לשניים 30 שאינם מטופלים מ"מ להפיץ את התערובת באופן שווה על ידי סיבוב.
24. המקום לשכפל צלחות צלחת 100 מ"מ יחד עם צלחת מים המכילים 3 מ"ל מים סטריליים. התרבות 14-17 ימים.
25. לאפיין התפלגות המושבות על פי המורפולוגיה שלהם עם מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 40X בצלחת תרבות המסומנים רשת הניקוד. לענין assay שלנו, במושבות מסווגים 3 קטגוריות: טהור erythroid, myelomonocytic, ומעורבים. ראה הנחיות היצרן עבור subclassification מושבה נוספת.
26. צלחת כולו assay CFC עשויים להיות סרק ללא הגדלה באמצעות סורק רגיל ב 600 dpi, צריכת חשמל נמוכה (40X) photomicrographs המושבות ניתן לקחת באמצעות מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמת צבע.
27. לצורך ניתוח נוסף של בידול ושגשוגם, התאים את הצלחת CFC כל assay הם התאוששו על ידי השעיית בכמה כרכים של בטמפרטורת החדר 2% FBS / IMDM. לאחר צנטריפוגה XG ב 300 דקות 10 ב 4 ° C, התאים resuspended ב 2% FBS / IMDM, נספר, ומוכתמת או עם נוגדנים cytometry זרימה או להעביר שקופיות באמצעות צנטריפוגות Cytospin עבור מכתים Giemsa.

נוגדן מכתים ואת זרימת cytometry

28. תאים צנטריפוגה XG ב 200 דקות 8 ב 4 ° C ו resuspend בסרום 50% קר עכבר רגיל HBSS (Ca & Mg חינם ללא פנול אדום).
29. המקום כ 5 x 10 ⁵ תאים לכל צינור μl 80 (12 x 75 מסביב לתחתית צינורות מ"מ) ולשמור על הקרח. הוסף תערובת נוגדנים (כ 20 תערובת μl או פתרון בקרת שלילי ללא נוגדנים שולטת) ומערבבים קלות על ידי הקשה על צינורות. הכן לשלוט צינורות כיול עם נוגדנים או לא עם נוגדן נגד CD45 לכל fluorochrome. המקום צינורות על הקרח בחושך דגירה במשך 20 דקות. מערבבים קלות על ידי הקשה על צינורות אחרי 10 דקות הראשונות. לאחר דגירה 20 דקות, ממלאים את צינורות עם HBSS קר צנטריפוגות ב XG 200 דקות 8 ב 4 ° C. Resuspend גלולה paraformaldehyde ב -0.5% / HBSS קר.
    תערובות הבאות של נוגדנים משמשים בדרך כלל עבור הניתוח שלנו. עבור בידול מיאלואידית: CD11b (phycoerythrin-מצומדות שיבוט ICRF44) / CD33 (allophycocyanin-WM53 מצומדות שיבוט) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated שיבוט HI30). עבור בידול erythroid: CD71 (phycoerythrin-מצומדות שיבוט M-A712) / CD235a (allophycocyanin-מצומדות שיבוט GA-R2) / CD45 (phycoerythrin-Cy7-congjugated שיבוט HI30).
30. Cytometry זרימה מבוצע על Core סדרן מהירות גבוהה נייד של ג'אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה על cytometer זרימה FACScan לשדרג ל 5 צבעים ושני לייזרים (BD Biosciences) ונותחו באמצעות CellQuest (BD Biosciences) או FlowJO v7.2.4 (עץ Star, Inc, אשלנד, או, ארה"ב) תוכנה.

Giemsa מכתים

31. כ 30,000 תאים התאושש צלחות CFC assay שתוארו לעיל מושעים ב 0.3 מ"ל 2% FBS / IMDM והועברו שקופית באמצעות צנטריפוגות Cytospin בסל"ד 1000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
32. הגדר ועולים בתשעה כלי מכתים המכיל הפתרונות לפי הסדר הבא.
    1. Absolute מתנול
    2. רייט / Giemsa מניות פתרון
    3. רייט / Giemsa חיץ, pH 6.4
    4. מתנול 50% H ₂ O
    5. H ₂ O
    6. H ₂ O
    7. חיץ פוספט, 6.0 pH
    8. H ₂ O
    9. H ₂ O
33. מניחים את השקופיות לתוך מנשא מגלשה לטבול מתנול אבסולוטי (# 1) עבור 2 דקות ו למחוק את עודף מתנול.
34. מיד לטבול המוביל שקופית פתרון מניות רייט / Giemsa (# 2) עבור 5 דקות.
35. העברת המוביל אל רייט / Giemsa חיץ, pH 6.4 (# 3) דגירה של 10 דקות.
36. טובלים את הספק פעמיים מתנול 50% (מס '4), 10 פעמים H ₂ O (# 5), עוד 10 פעמים H ₂ O (# 6), ולאחר מכן 5 פעמים חיץ פוספט, pH 6.0 (# 7) .
37. העברת המוביל לתוך H ₂ O (# 8) ו דגירה דקות 2. חזור על לשטוף ב H ₂ O (# 9).
38. אפשר השקופיות לאוויר יבש לחלוטין במנשא. הסר כל שקופית ולנגב את הגב של השקופית עם מתנול ספוג Kimwipes להסיר כתמים. מניחים ירידה של 60 Cytoseal וכוס לכסות לאטום.
39. ספירת 500 תאים ההפרש מבוצע עבור השקופית Giemsa מוכתמת כל באמצעות מיקרוסקופ BX51 אולימפוס. תאים מחולקים לחמש קטגוריות: תאים פרימיטיביים כוללים תקיעות ו promyelocytes; תאים מיאלואידית ביניים כוללים myelocytes ו metamyelocytes; תאים מיאלואידית בוגרת כוללים להקות, מפולח נויטרופילים, מונוציטים, ומקרופגים; ביניים תאים erythroid כוללות תאים עם hemoglobinization ביניים; ובוגרת תאים erythroid כוללים תאים עם hemoglobinization מלא. Photomicrographs הם שצולמו במצלמת אולימפוס DP71 במטרה שמן 60x.

3.0) תוצאות נציג:

1. Assay CFC: חלק מהאוכלוסייה תא קלט יתרבו, להבדיל, ומושבות טופס בינוני חצי מוצק בתקופה 14-17 ימי דגירה. בניסוי זה, ברור כי הביטוי של האונקוגן NUP98-HOXA9 גרמה להיווצרות אדום בולט (erythroid המושבות) (איור 1) (3).
2. מכתים נוגדן ו cytometry זרימה: זרימה immunophenotyping cytometric של תאים שנאספו צלחות CFC assay מספק מידע על מצב הבידול של האוכלוסייה התא. על ידי שימוש בשילוב של נוגדנים כנגד סמנים בידול מסוים, השושלת ואת מידת ההבשלה של התאים ניתן להעריך. במקרה זה CD235a שימש כדי לזהות תאים erythroid. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, NUP98-HOXA9 גרמה לעלייה באחוז התאים CD235a + erythroid, אבל את בהירות הביטוי CD235a ידי תאים אלה פחתה בהשוואה לקבוצת הביקורת, המציין עיכוב התבגרות erythroid. ב 2B איור, תאים מיאלואידית מזוהים מכוח חיוביות שלהם CD33. NUP98-HOXA9 גרמה לירידה במספר CD33 + תאים, עם ירידה בהירות הביטוי CD11b, עולה בקנה אחד עם עיכוב של התבגרות מיאלואידית (3). כך cytometry התוצאות הראו כי זרימת NUP98-HOXA9 גרם היפרפלזיה erythroid עם עיכוב של התבגרות הן מיאלואידית ו erythroid.
3. מכתים Giemsa: בדיקה מורפולוגית של התאים שנאספו צלחות CFC assay מספק מידע על השושלת ואת מידת ההבשלה של האוכלוסייה התא. המסקנות שהתקבלו מורפולוגית עשויים להיות שונים מאלה שהושגו על ידי מחקרים זרימת cytometric, ובכך שיטות אלה משלימים אחד את השני (3). הניסוי חוזר על עצמו לפחות 3 פעמים, ובכל פעם ספירת 500 תאים ההפרש מבוצע להבחין 5 קטגוריות של תאים כפי שתואר לעיל. דוגמאות של תאים אלה הצביע באיור 3. התוצאות הן tabulated ונותחו על מנת לקבוע אם יש הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין oncogene-transduced מדגם הביקורת. במקרה זה, התוצאות הראו כי NUP98-HOXA9 גרמה לעלייה הכללית במספרים של תאים, עם היפרפלזיה erythroid ועיכוב של שני erythroid והתבגרות מיאלואידית (3) (לא מוצג).

FIGURE האגדות

איור 1: השפעת NUP98-HOXA9 על מורפולוגיה CFC האדם.
ראשי אנושי CD34 + תאים היו retrovirally transduced עם או MSCV-IRES-GFP וקטור שליטה או וקטור להביע NUP98-HOXA9, ותאי מוינו חיוביות עבור ה-GFP. אלף תאים היו זורעים לתוך כל אחד שתי מנות כפולות עבור assay CFC ואת הניסוי חזר על עצמו 3 4 פעמים עצמאית. צלחות נציג ללא הגדלה (משמאל) photomicrographs צריכת חשמל נמוכה של נציג erythroid מושבות (מימין) מוצגים (3).

איור 2: תזרים cytometry מראה שיבוש CD34 העיקרי האדם + התמיינות תאים על ידי NUP98-HOXA9.
(א) cytometry זרימה עבור בידול erythroid: תאים מהצלחות CFC (ראה תרשים 1) נקצרו מוכתם נוגדנים CD45 ו CD235a. CD235a + השער היה זממו על (פאנל מימין) היסטוגרמה כדי להראות את הביטוי של CD235a ביחס לתאי הבקרה (ב) תזרים cytometry לבידול מיאלואידית: תאים מהצלחות CFC נקצרו מוכתם CD45 ו - CD33. CD33 + השער היה זממו על היסטוגרמה להראות ביטוי CD11b לעומת הבקרה (פאנל מימין). חלקם של התאים נפילה בתוך כל שער מוצגים (3).

איור 3: מורפולוגיה Cell מראה שיבוש של בידול על ידי NUP98-HOXA9 לעומת שליטה וקטור.
מריחות Cytospin הוכנו מהצלחות CFC ו מוכתמים Giemsa. Photomicrographs נלקחו לשדות נציג במטרה שמן 60x. ב ': הפיצוץ; MM: מיאלואידית בוגרת, IM: מיאלואידית ביניים, אני: erythroid בוגר, כלומר: erythroid ביניים (3).

Discussion

Assay CFC נמצא בשימוש נרחב על מנת לקבוע את תפוצת ואת דפוסי הבידול של אבות hematopoietic כדי לחקור את ההשפעות של אונקוגנים (4, 5). יש לו יתרון על פני תרבויות נוזלי להיות assay משובטים, כך המושבות לייצג את הצאצאים של אב יחיד ניתן להסיר באופן פרטני לצורך ניתוח נוסף. המגבלה של assay CFC היא שז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IMDM	Life Technologies	12440
FBS	Stem Cell Technologies	06150
L-Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin/Streptomycin (PS)	Life Technologies	15140
FLT-3 ligand	PeproTech Inc	300-19
GM-CSF	PeproTech Inc	300-03
SCF	PeproTech Inc	300-07
TPO	PeproTech Inc	300-18
IL3	PeproTech Inc	200-03
IL6	PeproTech Inc	200-06
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
EDTA	Fisher Scientific	BP118
Retronectin	Takara Bio Inc	T100A
HBSS	Life Technologies	14175
PBS	Life Technologies	14200
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Methocult GF+ H4435	Stem Cell Technologies	04445
Human Methylcellulose Enriched Media	R&D Systems	HSC005
Wright/ Giemsa stain	Harleco	64571
Phosphate Buffer Solution, pH 6.4 - Giordano formula	Ricca Chemical Company	1450
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Cytoseal 60	Thermo Fisher Scientific, Inc.	8310
Normal Mouse Serum	Rockland Immunochemicals	D208
Anti-Human CD11b phyc–rythrin-conjugated	BD Biosciences	555388
Anti-Human CD33 allophycocyanin-conjugated	BD Biosciences	551378
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated	BD Biosciences	557748
Anti-Human CD71 phyc–rythrin-conjugated	BD Biosciences	555537
Anti-Human CD235a allophycocyanin-conjugated	BD Biosciences	551336
Anti-Human CD45 phyc–rythrin-Cy7-congjugated	BD Biosciences	557748
24-well non-treated tissue culture plates	BD Biosciences	35-1147
30 mm non-treated dish	Stem Cell Technologies	27150
100 mm tissue culture dish	Fisher Scientific	08-757-12
Gridded scoring dishes	Stem Cell Technologies	27500
15 ml centrifuge tubes	BD Biosciences	35-2097
50 ml centrifuge tubes	BD Biosciences	35-2070
Syringes 3 ml	Stem Cell Technologies	28240
16 gauge blunt-end, 1½ inch needle	Stem Cell Technologies	28110
50 μm CellTrics cell filter	Partec	04-004-2327
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
TPX sample chambers	Thermo Fisher Scientific, Inc.	A78710018
Fisherbrand Superfrost/Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Shandon filter cards	Thermo Fisher Scientific, Inc.	5991022
Shandon cytospin slide holder	Thermo Fisher Scientific, Inc.	59920063
Shandon Complete Staining Assembly 100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	100
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
1 μm filter paper	VWR international	28307-134
Inverted microscope	Nikon Instruments	Diaphot
Microscope camera	Nikon Instruments	DS-F11
Microscope	Olympus Corporation	BX51
Microscope camera	Olympus Corporation	DP71
Scanner	Microtek	Scanmaker 4
Vortex mixer	Fisher Scientific	12-812
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC
Cytospin	Shandon, Inc.	Cytospin 2
Bench-top centrifuge	Eppendorf	5810-R
Water purification system	Barnstead	Nanopure-Diamond