פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

Summary

פרופיל איזוטופים יציבים ידי ניתוח כרומטוגרפיה מסת הגז spectrometric של השטף מטבולית מתווך מתואר נמטודות, Caenorhabditis elegans. שיטות מפורטים להערכת העשרת איזוטופים של פחמן דו חמצני, חומצות אורגניות וחומצות אמינו בעקבות חשיפת איזוטופ או במהלך הפיתוח על צלחות אגר או במהלך הבגרות בתרבות נוזל.

Abstract

פרופיל איזוטופים יציבים אפשרה רב בחקירות רגישות של ההשלכות המטבולית של מוטציות גנטיות ו / או טיפול תרופתי דגמי הסלולר יונקים. כאן אנו מתארים שיטות לבצע אפיון מפורט איזוטופים יציבים של מטבוליזם הביניים ו השטף מטבולית נמטודות, Caenorhabditis elegans. שיטות מתוארים על פרופיל שלם חינם תולעת חומצות אמינו, פחמן דו חמצני שכותרתו, חומצות אורגניות שכותרתו, וחומצות אמינו שכותרתו בבעלי חיים חשופים איזוטופים יציבים גם על הצמיחה נמטודות התקשורת צלחות אגר או תחילת כמבוגרים צעירים בהתפתחות המוקדמת תוך חשיפה לטיפולים תרופתיים שונים בתרבות נוזל. חומצות אמינו הן חינם לכמת ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) ב aliquots התולעת כל חילוץ בחומצה perchloric 4%. תווית אוניברסלי ¹³ C-גלוקוז או 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז מנוצל כמבשר איזוטופים יציבים אשר שכותרתו פחמן לייחס ידי ספקטרומטריית מסה של פחמן דו חמצני (שניהם אטמוספרי מומס), כמו גם מטבוליטים מעיד על השטף דרך הגליקוליזה , pyruvate חילוף החומרים ואת מחזור חומצה tricarboxylic. תוצאות נציג כלולים להדגים השפעות זמן חשיפה איזוטופ, פרוטוקולים שונים סליקה חיידקי, שיבוש שיטות חלופיות תולעת wild-type נמטודות, כמו גם את מידת יחסי ההתאגדות איזוטופי של המיטוכונדריה מורכבים III מוטציה תולעים (ISP-1 (qm150) ) ביחס ל wild-type תולעים. יישום פרופיל איזוטופים יציבים נמטודות חיים מספק יכולת הרומן לחקור ברמה כל חיה בזמן אמת שינויים מטבוליים אשר נגרמים על ידי הפרעות גנטיות הפרט ו / או טיפול תרופתי.

Protocol

פרוטוקול: פרופיל איזוטופים יציבים של מטבוליזם הביניים במהלך C. elegans פיתוח על צלחות NGM.

* הערה: להעשרת איזוטופ יציב ניתן למדוד בהצלחה אוכלוסיות נמטודות צעיר מבוגר בעקבות חשיפת איזוטופ (עם גלוקוז או ¹³ אוניברסלית שכותרתו C או 1,6 - ¹³ C _{2-גלוקוז)} מתחיל או בהתפתחות המוקדמת או בבגרות המוקדמת. פרוטוקול זה מאפשר ניטור במקביל של בריאות בעלי חיים, התפתחות, צמיחה צמיחה נמטודות על תקן התקשורת (NGM) צלחות, אשר אינה מושגת בקלות בתרבות נוזל.

1. הכינו מנות 100 מ"מ פטרי עם 10 מ"ל של התקשורת צמיחה נמטודות (NGM), לכל טכניקה תקן ^1.
2. NGM צלחות מורחים עם OP50 E. coli ¹ ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה.
3. הוספת 500 μL של 200 מ"מ 1.6 - ¹³ _ג'2 גלוקוז (להשיג ריכוז סופי של 10 מ"מ בצלחת NGM) אחיד לצלחת. לייבוש למשך הלילה.
4. Bleach הרה להולדת מבוגר תולעים ^1. פלייט התאוששה ביצים על צלחות NGM ללא חיידקים או 1,6 - ¹³ _ג'2 גלוקוז. לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. למחרת, להעביר בקעו, L1-נעצר הזחלים לצלחות NGM להפיץ בעבר עם 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז OP50 E. coli (לכל צעד מס '2, לעיל). לגדל תולעים לשלב הבוגרים הצעירים (48-72 שעות, תלוי מתח), תולעים נטילת טיפול לא לגווע ברעב.
6. איסוף סינכרוני, היום הראשון תולעים בוגרות צעירות צלחות עם 3-4 מ"ל של Basal ס.
7. לשטוף תולעים 50 מ"ל של Basal ס ב 50 צינורות מ"ל פלקון. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. הסר supernatant כדי מ"ל 5 ~. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
8. אומדן מספר התולעת על ידי ספירת three 100 aliquots μL ^2. התאם את הריכוז כדי תולעת תולעים 1000 / mL של הבסיס ס.
9. פיפטה 1 מ"ל (1000 תולעים) לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
10. הוסף 69 μL של 60% PCA המכיל פנימי סטנדרטי (ε-aminocaproic חומצה) לריכוז סופי של PCA 4% ו 200 μmol של תקן פנימי.
11. בואו תולעים ליישב על ידי x הכבידה 5 דקות. הסר ולשמור את supernatant בצינור אחר.
12. טוחנים בעזרת דגימות תולעת פלסטיק homogenizer (Kontes גלולה העלי) ו מקדח ממונע (מנוע Kontes גלולה העלי אלחוטי) למשך 15 שניות. ראייה לאשר שיבוש תולעת על ידי מיקרוסקופ אור. חזור במידת הצורך.
13. מעבירים את supernatant משלב # 11 לשלב עם homogenate משלב # 12.
14. צנטריפוגה מדגם ב 2250 סל"ד (1300 XG) במשך 5 דקות.
15. העברת supernatant אל צינור טרי 7 מ"ל זכוכית. שמור גלולה עבור assay ריכוז חלבון, כמפורט צעד # 20, להלן.
16. דגימות ה-pH טווח (ניטראלי) 7-8 באמצעות 4N KOH.
17. צנטריפוגה דגימות לנטרל בצינור זכוכית 7 מ"ל ב 2250 סל"ד (1300 XG) במשך 5 דקות כדי להסיר מלחים.
18. העברת supernatant אל צינור טרי 7 מ"ל זכוכית.
19. הכינו דגימות לנטרל עבור quantitation המטבוליט על ידי:
    1. ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה (HPLC): μL נפרדת 50 מדגם לנטרל עבור הזרקה ישירה לתוך HPLC. חומצת אמינו חינם quantitation מבוצע על ידי HPLC (וריאן) באמצעות טרום טור derivatization עם זיהוי O-phthalaldehyde ו ניאון, כפי שתואר לעיל ^3-4.
    2. גז כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה (GC / MS): המשך מיצוי של דגימות לנטרל הנותרים באמצעות חילוף יונים שרף (Bio-Rad) להגדרה GC / MS העשרת איזוטופים של חומצות אמינו וחומצות אורגניות, כמפורט בפרוטוקול ד
20. הוסף 1 מ"ל של NaOH 1N לחלבון גלולה הנותרים (משלב # 15) שפופרת זכוכית 7 מ"ל.
21. דגירה NaOH שטופלו מדגם חלבונים בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב (Labnet * Rotator LabRoller) לילה עד שהיא נמסה.
22. השתמש 75-100 μL של חלבון NaOH שטופלו כדי לקבוע ריכוז חלבון על ידי שיטות סטנדרטיות (Assay DC חלבון, Bio-rad).

פרוטוקול ב 'פרופיל איזוטופים יציבים של חילוף החומרים ביניים ב C. elegans צעירים בתרבות נוזל.

* הערה: תופעות תרופתי על השטף מתווך מטבולית נמטודות מבוגר ניתן ללמוד בעקבות תחילת החשיפה איזוטופי ביום הראשון של ההטלה או על צלחות NGM (ראה פרוטוקול, לעיל) או בתרבות נוזל. אנו מעדיפים את הגישה השנייה על מנת למקסם את יעילות העלות של איזוטופ יציב וניצול תרופתי סוכן.

1. מדולל סינכרוני, ביום הראשון ההטלה צעירים ב ס הבסיס מכיל כולסטרול 0.0005% (מתקבל על ידי הוספת 0.5 מ"ל של כולסטרול 1% (מומס אתנול 95%) עד 1 ליטר ש בסל) עד ​​2000 בעלי חיים לכל μL 500.
2. הגדרת ~ 4 תרבות מ"ל הנפח הכולל (ים) ב 25 צלוחיות מ"ל Erlenmeyer, כדלקמן:

   טיפול:	NONE	"סם"
   ס בסל עם כולסטרול	3020 μL	3020 UL - "תרופות" נפח
   איזוטופ יציב (1,6 - 13 C 2-גלוקוז)	80 μL	80 μL
   K12 E. coli (OD 660 2.5-3)	400 μL	400 μL
   למבוגרים תולעים יאנג (2000)	500 μL	500 μL
   והתרופות (הריכוז הרצוי)	-	כפי הרצוי

3. מכסים ברדיד צלוחיות. Shake צלוחיות במשך 24 שעות בכל סל"ד 220 ב 20 ° C מודגרות פלטפורמה שייקר.
4. ודא צלוחיות לא אטום לחלוטין, כמו חמצן נדרשת עבור השטף מטבולית מתווך ועל וכתוצאה תיוג של מטבוליטים נמטודות אנדוגני.
5. לשטוף תולעים על ידי הוספת 4 תרבות נפח מ"ל ל 46 מ"ל של הבסיס ס בצינור מ"ל 50 חרוטי פלסטיק. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. אבק supernatant אל ~ 5 מ"ל נשאר יניקה. חזור על לשטוף על ידי מילוי צינור פעמיים יותר 50 מ"ל עם הבסיס ס.
6. תתרכז תולעים שטף עד 1000 תולעים / mL של צינור פלסטיק 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
7. הוסף 69 μL של חומצה perchloric 60% (PCA) ו - 2 μL של 10 מיקרומטר פנימי סטנדרטי (ε-aminocaproic חומצה) כדי להשיג ריכוז סופי של תקן 200 μmol פנימית PCA לבין 4%.
8. הכינו דגימות כמו לכל הצעדים # 11-22 בפרוטוקול א

PROTOCOL-C-1. ניטור ניצול איזוטופי של תולעים בוגרות על צלחות על ידי התחקות שכותרתו פחמן דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מומס.

* הערה: בעוד הפרוטוקולים ושיטות B פרט לפקח ההתאגדות איזוטופ לתוך מטבוליטים חינם בתוך תולעים במשך 2-3 ימים של התפתחות או 1 יום של החיים הבוגרים, בהתאמה, אישור ברוטו של ההצלחה קינטיקה ההתאגדות איזוטופי במשך זמן קצר (כלומר, דקות עד שעות) ניתן להשיג על ידי תווית ניטור דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה (CO ₂₎ שוחרר מן תולעים או הכלול פחמן דו חמצני מומס בתוך לחלץ תולעת. חיידקים חיים או נהרגו יכול להיות מוזן על תולעים כאשר גדל על צלחות (פרוטוקול C-1). חיידקים אין צורך בחשיפה לטווח קצר איזוטופ של תולעים בתרבות נוזלי (פרוטוקול C-2).

1. הכינו מנות 100 מ"מ פטרי עם 10 מ"ל של אגר NGM. מורחים צלחות NGM עם או לחיות או UV-נהרגה OP50 E. coli (כפי שמודגם באיור 1). אפשר צלחות לייבוש למשך הלילה.
2. הוספת 500 μL של 200 מ"מ 1,6 ^{שכותרתו-13} _C-2 גלוקוז אל OP50 NGM צלחות התפשטות (ריכוז האיזוטופ הסופי של 10 מ"מ בצלחת NGM). אפשר צלחות לייבוש למשך הלילה.
3. השג סינכרוני, ביום הראשון ההטלה, תולעים בוגרות צעיר גדל על צלחות אגר NGM להפיץ רק עם OP50 E. coli.
4. העברת 1,000 תולעים בוגרות צעירות ניסיוני צלחות אגר NGM המכיל איזוטופ יציב וא coli (מוכן כמו לכל הצעדים # 1-2, לעיל).
5. NGM ניסיוני צלחת מניחים (ללא כיסוי) בתא זכוכית אישית מצויד שסתום 3 כיווני אטום היטב כדי לאפשר דגימה האווירה החלפת מדויק. מיד לתאי חותם עם דיסק זכוכית שקוף אופטית. כיסוי תפר שבו זכוכית הדיסק יושב על צלחת עם גריז ואקום גבוה כדי לאטום. שיא הזמן "0 Time".
6. 10 מ"ל לדוגמה האווירה מתא הזכוכית על ידי שסתום 3-way עם מזרק 20 מ"ל ב 30 דקות, 60, 90 ו - 120. העברת כל מדגם אטמוספרי כדי פקק מוכנה מראש גומי 10 מ"ל עקף שפופרת זכוכית המכילה 1 מ"ל של 1 mM NaHCO ₃ ב 0.1 N NaOH כי כבר נחתם בוואקום.
7. הזרק 10 מ"ל של הגב אוויר לתוך תא הזכוכית בכל דרך שסתום 3 דרך באמצעות מזרק 20 מ"ל. סגור שסתום אל החדר לאחר דגימה / reinjecting האווירה לפני חידוש הדגירה בין נקודות הזמן האוסף.
8. להזריק 100 μL של חומצה זרחתית 20% דרך הפקק לתוך פקק גומי 10 מ"ל עקף שפופרת זכוכית המכילה מדגם CO ₂ באטמוספרה.
9. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק אותו לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO ₂ באטמוספרה.
10. ניתוח "באטמוספירה CO ₂ דוגמאות" על ידי גז יחס ספקטרומטר מסה (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס).
11. זכוכית חדרי פתח בעקבות שני תקופת דגירה איזוטופ שעה אוסף של כל דגימות אטמוספרי.
12. לשטוף תולעים מצלחות NGM באמצעות 3 מ"ל של הבסיס ס.
13. לשטוף תולעים הבסיס 50 ס מ"ל 50 מ"ל צינורות פלקון. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
14. תתרכז תולעים ~ 1000 תולעים / mL בצינור 7 מסביב לתחתית הכוס מ"ל (ים).
15. חותם אבק צינור זכוכית עם פקק גומי.
16. הוספת 100 μLשל חומצה זרחתית 20% באמצעות פקק גומי עם מזרק לשחרר מומס CO _2.
17. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO ₂ מומס.
18. ניתוח "מומס CO ₂ דוגמאות" על ידי ספקטרומטר גז יחס המוניים (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס).

אלטרנטיבי Protocol (C-2): ניצול ניטור איזוטופי של תולעים בוגרות בתרבות נוזלי על ידי התחקות שכותרתו פחמן דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מומס.

1. השג סינכרוני, תחילה ההטלה יום, צעיר מבוגר תולעים גדל על צלחות אגר NGM התפשטות עם OP50 E. coli.
2. לשטוף תולעים 50 מ"ל של הבסיס ס ב 50 צינורות מ"ל פלקון. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. הסר supernatant כדי מ"ל 5 ~. חזור רוחץ פעמיים נוספות.
3. העברת 1,000 תולעים בוגרות צעירות הבסיס ש 1 מ"ל ל 10 צינור עגול התחתונה מ"ל זכוכית. הוסף μl 10.1 ממניות M 1 מתוך אוניברסלית שכותרתו ¹³ C-הגלוקוז 1 מ"ל של תולעים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 10 מ"מ.
4. חמצן סביב תחתית זכוכית צינור שהכיל תולעים איזוטופ ידי החלפת האווירה זורם עם 100% חמצן בצינור פתוח במשך 2 דקות. מיד לסגור צינור עם פקק גומי.
5. Shake צינורות ניסיוני 20 ° C מודגרות פלטפורמה שייקר ב 220 סל"ד. שיא החל זמן כמו "0 Time".
6. 5 לדוגמה מ"ל של האטמוספירה מהצינור 10 מ"ל מסביב לתחתית הכוס באמצעות מזרק 10 מ"ל ו - 25 מחט מד באמצעות פקק גומי דקות 30, 60, 90 ו - 120.
7. העברת כל מדגם אטמוספרי כדי פקק, מוכנה מראש גומי מצופה זכוכית 10 מ"ל שפופרת המכילה 1 מ"ל של 1 mM NaHCO ₃ ב 0.1 N NaOH כי כבר נחתם בוואקום.
8. הזרק 5 מ"ל של אוויר לתוך הצינור בחזרה בכל סיבוב התחתונה ניסיוני זכוכית המכיל תולעים איזוטופ באמצעות פקק גומי באמצעות מזרק 10 מ"ל ו - 25 מחט מד.
9. קורות חיים הדגירה של הניסוי 10 מ"ל מסביב לתחתית צינורות זכוכית המכיל תולעים איזוטופ ידי רועדת על 220 סל"ד בין נקודות הזמן האוסף.
10. להזריק 100 μL של חומצה זרחתית 20% באמצעות פקק לאטמוספרה המכילה פקק גומי עקף 10 מ"ל שפופרת זכוכית.
11. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO ₂ באטמוספרה.
12. ניתוח "באטמוספירה CO ₂ דוגמאות" על ידי גז יחס ספקטרומטר מסה (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס).
13. בתום תקופת הניסוי, לשטוף תולעים הבסיס 50 ס מ"ל בשפופרת פלקון 50 מ"ל. אפשר ליצור תולעת גלולה על ידי כוח הכבידה. אבק supernatant אל ~ 5 מ"ל נשאר יניקה. חזור על לשטוף את ידי פעמיים נוספות ב 50 מ"ל של הבסיס ס.
14. תתרכז תולעים ~ 1000 תולעים / mL בצינור 7 מסביב לתחתית מ"ל זכוכית. הוסף פקק גומי חותם צינורית ואקום. הוספת 100 μL של חומצה זרחתית 20% באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 מד דרך פקק הגומי לשחרר תולעת CO ₂ מומס.
15. הסר 2 האווירה מ"ל ו להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO ₂ מומס.
16. ניתוח "מומס CO ₂ דוגמאות" על ידי ספקטרומטר גז יחס המוניים (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס).

פרוטוקול ד עיבוד לנטרל דגימות הפרוטוקולים A ו-B עבור חומצת אמינו וניתוח חומצה אורגנית על ידי ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה / מסה.

1. ביד אופן ההכנה:
   1. הוסף 1 N HCl לשני Ag 1 ו Ag 50 חרוזים בנפרד כוסות 1L.
   2. מוסיפים את כל בקבוק במשך 30 דקות עם stirrer מגנטי.
   3. לשטוף עם מים חרוזים deionized 10 פעמים עד pH של כביסות שווים pH של המים.
2. טור אופן ההכנה:
   1. הוספת תוסף כותנה בדיוק מעל החלק הצר ביותר של פסטר פיפטה קצה.
   2. הוסף חרוזים טעונה לכל אחד שתי עמודות לפי המדגם, מילוי כל כ שליש גובה העמודה. השתמש AG1 חרוזים להפקת חומצה אורגנית. השתמש AG50 חרוזים להפקת חומצה אמינית.
3. לדוגמה עיבוד:
   1. הוספת 500 μL המדגם לעמודה עם חרוזים AG1 טעונה. דבר נוסף במדגם (ראה פרוטוקול, צעד # 19B) לפני יישום לעמודה AG1 לחלץ חומצות אורגניות, אם המדגם הוא כבר ב-pH נייטרלי.
   2. הוסף 1 מ"ל של 0.1 N HCL המדגם הנותרים לפני החלת אותו טור AG50 כדי לחלץ חומצות אמינו.
   3. דוגמאות אפשר לרוץ לחלוטין באמצעות עמודות.
   4. לשטוף עם מים עמודה 10 פעמים עד כביסות ניטרליים (7-8 טווח ה-pH).
   5. Elute עמודות טריים, שכותרתו 4 צלוחיות זכוכית מ"ל מדגם:
      1. להפקת חומצה אורגנית, להוסיף 3mL של 3 N HCl לעמודה AG1. זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופ במספר הכולל של פחמנים שכותרתו בין 3-פחמן מינים (לקטט), 4-פחמן מינים (aspartate, succinate, Malate)5 פחמן מינים (גלוטמט), ו -6 פחמן מינים (ציטראט).
      2. להפקת חומצות אמינו: להוסיף 3mL של 4 N NH ₄ OH לעמודה AG50. זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופ במספר הכולל של פחמנים שכותרתו בין 3-פחמן מינים (אלאנין) ו -5 פחמן מינים (גלוטמין).
   6. מניחים את בקבוקוני לדוגמה Reacti-VAP III המאייד לילה עד יבש.

א Derivitization לדוגמה והגדרות מכונת עבור המוניים ספקטרומטריית

הוסף 50 μL של אצטוניטריל ו 50 μL של N-methyl-NT-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) כדי בקבוקון כל המדגם. מכסים, מערבבים דגירה במשך 30 דקות על 60 ° C. הזרק 1-2 μl לדגימה לתוך ספקטרומטר גז כרומטוגרפיה / המוניים (GC / MS).

פ ניתוח של תוצאות

1. כימות של פסגות חומצת אמינו. Quantitation של חומצת אמינו זו על ידי ניתוח HPLC מחושב לפי השטח היחסי של כל אחד השיא לזה של התקן פנימי.
2. חישוב העשרת איזוטופים. העשרת איזוטופים יציבים מחושב ב-Excel (Microsoft) עבור כל מין על פי הנוסחה הבאה: אחוז עודף Atom, תיקן (APE) = (R _{SA-R רח')} * 100 / [(R _{SA-R רח')} 100], כאשר R _SA - יחס המדגם _רחוב R - יחס של תקן.
3. הערכת הבדלים סטטיסטיים בין העשרה מדגם. הסטודנטים של t-מבחן משמש כדי להעריך את המשמעות של חומצת אמינו יחסית הבדלים בתווית איזוטופי בין דגימות.

נציג תוצאות:

איזוטופ יציב היטב שולבו תולעים בוגרות צעירות, כפי שמעידים פחמן שכותרתו נמדד באטמוספירה CO ₂ ו-CO 2 מומס תולעת. בשנת תולעים נמאס או חי או UV-מוקרן נהרגו OP50 E. coli, יחס של ¹³ CO CO _{פבואר ^02-12} היה גדול יותר ב-CO ₂ חלקיק מומס תולעת יחסית ל-CO ₂ באטמוספרה שוחרר (איור 1). תולעים האכלה לחיות או הרג OP50 E. coli לא לשנות באופן משמעותי הנמדד ^{13 _2-12} CO-CO ₂ יחס בתמצית תולעת שטף (ראה פרוטוקול C1).

חשיפה ממושכת איזוטופ יציב מתקופת הזחל מוקדם גדל העשרת איזוטופים של מטבוליטים מתווך. תיקון אטומים עודף אחוז פחמן שכותרתו נקבע מטבוליטים מתווך של wild-type תולעים צעירים למבוגרים היה גדול על פני כל מיני תולעים גלוטמט כאשר הואכלו אוניברסלית שכותרתו ¹³ C-גלוקוז חיידקים חיים בכל התפתחות ביחס חיות שטופלו באופן דומה נמאס חיידקים שכותרתו עבור 48 שעות בלבד לאחר שהגיע ההטלה בשלב הבוגר (איור 2).

השפעת ניקוי פעמים על העשרת איזוטופים. ללא קשר timecourse חשיפה, כל בעלי החיים גדלו על הצלחות היו "פינה" של התווית איזוטופי לפני הכנת במורד הזרם עבור GC / MS מנתח. השוואה של פרוטוקולי הסליקה בוצעה כפי שמוצג באיור 2, כולל האכלה תולעים עבור 2 שעות על צלחות אגר NGM עם התפשטות חיידקים טריים לחיות בלי איזוטופ או האכלה על צלחות אגר NGM ללא חיידקים למשך 2 שעות, האכלה על צלחות אגר NGM ללא חיידקים או 2 או 6 שעות. ללא קשר, כמובן, החשיפה איזוטופי, אין הבדל משמעותי העשרת איזוטופים של מטבוליטים מתווך מתמצית התולעת הבוגרת צעיר שלם נצפתה כאשר החיות פונו על צלחות ללא חיידקים או 2 או 6 שעות. לעומת זאת, העשרת איזוטופים פחות נצפתה מטבוליטים מתווך כאשר החיות היו לאחר מכן "פינה" של איזוטופ עודף האכלה על ידי חיידקים ללא תווית במשך שעתיים. עם זאת, גדל העשרה 3, 4, ו 5 מינים ניכרה כאשר תולעים נחשפו איזוטופ מתקופת הזחל מוקדם. לפיכך, פרוטוקול ניקוי אופטימלי היה נחוש בדעתו להיות ניקוי תולעים הבאים הדגירה שלהם על צלחות NGM התפשטות חיידקים עם איזוטופ יציב על ידי הדגירה לאחר מכן עבור 2 שעות על צלחות NGM unspread. ראוי לציין, תולעים גדל בתרבות נוזל נשטפו ברורה של התווית חיידקים איזוטופי בשלושה כרכים של הבסיס ס (ראה פרוטוקול B); GC / MS וניתוח של כביסות לא הראו העשרה איזוטופי משמעותי על ידי לשטוף השלישי.

תולעת שחיקה הניב העשרה מירבית של מטבוליטים מתווך. כדי למטב את העשרה אחוז מטבוליטים מתווך התנאים הבאים לטיפול דומה, נעשתה השוואה של דגימות תולעת מופרת על ידי sonication לבד או sonication בתוספת טחינה. איור 3 מראה כי תולעים שיבשו חשיפה איזוטופ הבאים על ידי sonication בתוספת טחינה היה העשרת איזוטופים יותר דגימות מופרת רק על ידי sonication. נתונים אלה מראים כי שברים יותר משנה האורגניזם שובשו על ידי שחיקה מאשר sonication. מחקרים מאוחרים יותר גילו שחיקה לבד בלי sonicatio n היה די כדי להשיג את העשרת איזוטופים מקסימלי (מידע לא מוצג).

חשיפה תולעת שלמים איזוטופי היתרי ניתוח של השתנות ביניים מסלול מטבולי. האכלה עם תולעים חיים מבשר איזוטופים יציבים או במהלך הפיתוח (פרוטוקול, תרשים 4 א) או בתחילת בחיות בשלב הבוגר (פרוטוקול ב ', תרשים 4 ב) אישורים ניתוח רגישות של העשרת איזוטופים בין מטבוליטים מעיד על השטף דרך הגליקוליזה (לקטט, אלאנין), pyruvate חילוף החומרים (אלאנין), ואת מחזור חומצה tricarboxylic (ציטראט, Malate, succinate, aspartate, גלוטמט, גלוטמין ו). אוניברסלי שכותרתו ¹³ C-הגלוקוז מספק תיוג חזקים של כל מיני פחמן, בעוד הניצול של 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז היתרי תיוג חזקים רק 1 מינים של כל המטבוליט. טכניקה זו יכולה להבחין בהבדלים ברגישות של wild-type השטף מתווך תולעת מטבולית בקרב המיטוכונדריה שרשרת הנשימה זנים מוטנטים, כגון מורכבות III שרשרת הנשימה במיטוכונדריה למקטע מוטציה isp-1 (qm150). איור 5 מדגים את סדר הגודל של ההבדלים שנצפו תווית מוחלטת בין isp-1 (qm150) ותולעים N2 כל חשוף במשך 24 שעות 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז בתרבות נוזל עם K12 E. חיידקים קולי מהיום הראשון של ההטלה שלב הבוגרים הצעירים (פרוטוקול B). מחקרים נוספים איזוטופים יציבים בטווח של תולעים מוטציה במיטוכונדריה נמצאים בעיצומם.

באיור 1. אוניברסלי שכותרתו ¹³ C-גלוקוז איזוטופ יציב היה טוב שולבו תולעים בוגרות צעירות ¹³ CO _2: ^12. CO ₂ יחס (אטומים עודף אחוזים (APE), תיקן) ב wild-type (N2) תולעים הבאים שעתיים האכלה אוניברסלית- שכותרתו ¹³ C-גלוקוז או UV-נהרגו או לחיות OP50 חיידקים על צלחות (פרוטוקול C1). C ¹³ הכללתו מטבוליטים התולעת היתה איתנה לאחר שעתיים של חשיפה איזוטופ. ברים כחול ואדום עולה העשרת איזוטופים יחסית בשלב גז ("באטמוספירה CO _2") לבין שלב נוזלי ("תולעת CO _2"), בהתאמה.

איור 2. חשיפה ממושכת איזוטופ מתקופת הזחל מוקדם ומאוחר "ניקוי" תולעים על צלחות אגר NGM ללא חיידקים גדל העשרת איזוטופים של גלוטמט ללא תולעים בוגרות צעירות. העשרת איזוטופים במינים גלוטמט מוצג עבור תולעים שניזונו NGM צלחות אגר עם אוניברסלית שכותרתו- ¹³ C-גלוקוז OP50 חיידקים או במהלך הפיתוח משלב L1 הזחל דרך שלב 959 מבוגרים צעירים תאים ("L1", ראה פרוטוקול), או ארבעים ושמונה שעות לאחר תחילת תולעים הגיע היום הראשון של ההטלה צעיר בשלב הבוגר ("יא"). ציר ה-X מציין את המספר הכולל של אטומי פחמן מסומן בכל מיני גלוטמט. ציר Y מציין את העשרה אחוז (אטומים מתוקן לכל עודף (APE)). ברים ירוק עולה תולעים פינה חשיפה איזוטופ הבאים על ידי האכלה OP50 E. coli ללא איזוטופ על צלחות NGM שעתיים לפני מיצוי PCA. ברים כחול ואפור מצביעים תולעים פינה חשיפה איזוטופ הבאים על צלחות NGM ללא חיידקים או איזוטופ עבור שתיים או שש שעות, בהתאמה, לפני מיצוי PCA.

איור 3. שיבוש תולעים על ידי שחיקה התשואות העשרת איזוטופים מקסימלי של מטבוליטים תולעת מתווך. העשרה אחוז הפחמן נמדד 1 מינים ציטראט ב wild-type תולעים שטופלו במשך 24 שעות בתרבות נוזל עם 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז ללא חיידקים (פרוטוקול B). בארים שחור ואפור מצביעים ותולעים שובשו על ידי sonication בלבד או על ידי sonication וטחינה, בהתאמה. העשרת איזוטופים הבאים חשיפה 1,6 - ¹³ _C-2 גלוקוז מוערך ביותר מטבוליטים שכותרתו על פחמן אחד. לעומת זאת, התווית מועשר בכל מיני כל המטבוליט כאשר אוניברסלית ^{שכותרתו-13} C-גלוקוז מנוצל.

איור 4. תוצאות נציג להמחיש את היקף העשרת איזוטופים של מתווך מטבוליטים תולעת מעיד על השטף דרך הגליקוליזה, מטבוליזם pyruvate, ואת מחזור חומצה tricarboxylic. מתוקן אטומים עודף אחוזים (APE) נקבע צעיר wild-type מבוגר (N2 בריסטול) תולעים הבאים 1, ^6-13 _C-2 גלוקוז או חשיפה (א) במהלך הפיתוח משלב L1 על צלחות (פרוטוקול), או (ב) החל ביום הראשון של ההטלה כבוגרים צעירים למשך 24 שעות בתרבות נוזלי (פרוטוקול B) . ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן שבו נתונים איזוטופי אמין משלושה ביולוגי משכפל היה זמין.

= "Jove_content">
איור 5. Quantitation מוחלט חומצת אמינו של מינים חומצת אמינו מטבוליט של wild-type ו המיטוכונדריה זנים התולעת מוטציה. התווית מוחלט לכל מין של ארבע חומצות אמינו היה מחושב על ידי הכפלת HPLC שנקבע ריכוז חומצת אמינו חופשית (nmol / מ"ג חלבון תולעת) על ידי עודף אטומים תיקן אחוזים (APE) עבור כל מין. ברים אפור ושחור מעידים wild-type (N2 בריסטול) ו המיטוכונדריה זני מורכב III למקטע מוטציה (ISP-1 (qm150)), בהתאמה. ברים לציין ממוצע של שלושה ניסויים ביולוגיים לשכפל לכל זן.

Discussion

יישום ספקטרומטריית מסה כדי למדוד שפע איזוטופי של מטבוליטים מתווך מעניק תמונה מפורטת להפליא של שינויים ביוכימיים קריטי ^5. הנה, סיפקנו פרוטוקולים מפורטים לניצול במתודולוגיה זו רגישה וספציפית להעריך מטבולית השטף כמתווך החיה מודל צדדי גנטית, C. elegans. ואכן, להזנת בעלי חיים החיים עם איזוטופ יציב שכותרתו מבשרי מטבוליות (כגון ^{13-C-גלוקוז)} מאפשר תובנה הרומן לתוך השטף מסלול מטבולי מתווך כאשר מודדים העשרת איזוטופים של מטבוליטים במורד הזרם. פיתחנו מתודולוגיה אמינה לקבל ניתוח החזקה של השטף דרך הגליקוליזה, מטבוליזם pyruvate, ואת מחזור חומצה tricarboxylic. זו יכולה להיות מושגת הן חיות נמאס איזוטופ יציב מראשית שלבי התפתחות הזחל או לתחילת בתקופה שלאחר mitotic הבוגרת. העשרת איזוטופים במינים שונים המטבוליט ניתן ללמוד יחד עם פרופיל שלם חינם תולעת חומצת אמינו על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי, כפי שתואר לעיל ^4, כדי לקבוע העשרת איזוטופים מוחלט מינים שונים של אלאנין תולעת בחינם, aspartate, גלוטמט, גלוטמין ו. ואכן, דפוסים עקביים של העשרת איזוטופים מתקבלים כאשר מודדים חומצת אמינו ו analytes חומצה אורגנית aliquots של 1,000 עד 2,000 תולעים צעירות סינכרוני מבוגר. מתודולוגיה כזאת יכולה להבחין ברגישות השטף מתווך חריגה בגן מבוססי זנים מוטציה גרעינית המיטוכונדריה יחסית wild-type תולעים.

טכניקה זו בעלת ערך לחקור שינויים השטף במסלולים ביוכימיים מסוימים של רלוונטיות הטעויות המולדות נפוץ של חילוף החומרים. בפרט, את הניצול של גלוקוז שכותרתו עם איזוטופ יציב מודיע השטף פחמן באמצעות מסלולים מטבוליים המרכזי של הרלוונטיות למחלה המיטוכונדריה. ואכן, הנתונים שלנו מצביעים על היישום של מתודולוגיה כזאת יכולה להבחין ברגישות השטף מתווך חריגה גרעינית גן מבוססי זן המיטוכונדריה מורכבים למקטע השלישי מוטציה (ISP-1 (qm150)) ביחס ל wild-type תולעים.

חשוב להכיר כי מאז החשיפה איזוטופי הושלמה על פני תקופה של שנה עד מספר ימים, העשרת איזוטופים לכמת מייצג "מצב יציב" העשרה ערך ולא השטף לכימות על פני תקופה מוגדרת של זמן יכול להיות נחוש בתא מבוססי מודלים חשופים איזוטופ לתקופה של דקות עד שעות. מגבלה נוספת הפוטנציאל של חוקר השטף מסלול במהלך פיתוח נמטודות מתייחס באורכים שונים של התפתחות הזחל המתרחשים שמוטציות בפרט. לדוגמה, רבים מוטציות המיטוכונדריה חמורים ידועים כגורמים לעצור את השלב השלישי הזחל (L3) ^6. לפיכך, ניתוח ההתאגדות איזוטופ רק חיות לשרוד לבגרות לא יכול להיות מייצג של האוכלוסייה כולה מוטציה. עם זאת, המתודולוגיה זה יכול להיות מותאם על מנת להעריך ההתאגדות איזוטופי של מטבוליטים מתווך בשלב הזחל ספציפיים (כגון L2), ולא מחכה חיות להגיע לשלב הבוגר. באופן דומה, חיות להיכנס בשלב הזחל חלופה המכונה dauer סביר שינו באופן משמעותי את השטף (סביר התחתון) מטבולית יחסית בעלי חיים להמשיך ישירות דרך ארבעה שלבים הזחל. מחקר עתידי יכול גם להתבצע ישירות להעריך ההתאגדות איזוטופי בחיות dauer שלב של רקע גנטי שונה. חשיפת בעלי חיים איזוטופ יציב לתקופת זמן קבועה (כאן, 24 עד 48 שעות) בתחילת פעם חיות הגיעו לשלב הבוגר הצעיר (כמפורט בפרוטוקול B) מסיר את ההשפעה של תקופות התפתחותי משתנה. בעוד ¹³ C-גלוקוז רק חוקר מטבוליזם הגליקוליזה, pyruvate ושטף tricarboxylic מחזור חומצה, קליעים נותבים איזוטופים אחרים שעלולים להיות העריכו לחקור השטף מסלול ביוכימי דרך מסלולים אחרים של עניין נמטודות. לדוגמה, ¹⁵ N-גליצין עלול להיות מנוצל על מנת להעריך מחזור חומצת אמינו נמטודות.

מגבלה נוספת הפוטנציאל של גישה זו היא רמת הרגישות של זיהוי המטבוליט. הניסיון שלנו מצביע על מינימום של 500 נמטודות מבוגרים צעירים נדרשים בהצלחה לכמת ההתאגדות איזוטופי על ידי שיטות HPLC ו - GC / MS מועסק כאן. שימוש של מכשירים עם רגישות רבה יותר, כגון כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC), רשאי להתיר הפחתה נוספת של מספר בעלי חיים למד, למרות שאנו צופים זה סביר לאפשר quantitation אמין של מטבוליטים ושילוב איזוטופי לתוך מינים המטבוליט מפני תולעים יחיד. למדנו אוכלוסיות תולעת של 1,000 בעלי חיים לכל ניסוי, אשר מצאנו באופן מהימן לזהות מטבוליטים שפע נמוך כל זן. אולם, מטבוליטים מסוימים, כגון גאבא, יכול להיות רק לכמת באופן אמין אוכלוסיות הרבה יותר גדול של נמטודות, בסדר גודל של1x10 ⁶ חיות ^4.

לסיכום, אפיון איזוטופ יציב מספק פולשנית ובטוחה (לא רדיואקטיבי) הגישה כבר זמן רב מנוצל ללימוד הטעויות המולדות של חילוף החומרים. יישום מתודולוגיה זו ג elegans מספק את קיבולת הרומן לחקור in vivo, בזמן אמת, שינויים מטבוליים המתרחשים ברמת חיים שלם, אשר עלול לגרום הפרעות גנטיות מן הפרט ו / או סוכן חשיפות תרופתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S. basal		1 - page 59	Protocols A and B
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C-8503	Protocol B
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocols A and C
K12 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center		Protocol B
NGM agar	Research Products International Corp.	N81800-1000.0	Protocols A, B, and C
13C glucose (universally labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-1396	Protocol A and C
13C glucose (1,6 labeled)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-2717	Protocol B
60% Perchloric acid (PCA)	Fisher Scientific	MK2766500	Protocols A and B
ε-aminocaproic acid (Internal Standard)	Sigma-Aldrich	A-2504	Protocols A and B
MTBSTFA	Regis	270243	Protocol E
Acetonitrile	Regis	270010	Protocol E
AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin	Bio-Rad	140-1441	Protocols A and B (organic acid extraction)
AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin	Bio-Rad	142-1441	Protocols A and B (amino acid extraction)
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S-8875	Protocol C
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045	Protocol C
3N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
1N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol A
0.1 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Protocol D
4N NH4OH	Sigma-Aldrich	30501	Protocol D
4N KOH	Sigma-Aldrich	484016	Protocols A and B
Deionized water	Milli Q Biocel	ZMQA60F01	Protocol D
Helium	Airgas	24001364	Protocol C2
SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope	Nikon Instruments	NI MNA41000	Protocols A, B, and C
pH meter	Fisher Scientific	S68167	Protocols A and B
Table top centrifuge - 5804R	Eppendorf	05-400-93	Protocols A and B
Incubated platform shaker	New Brunswick Scientific	M1324-0004	Protocol B
Mini LabRoller Rotator	Labnet International	H-5500	Protocols A and B
Pestles	Kontes Corp	K749520-0090	Protocols A and B
Drill	Kontes Corp	K749540-0000	Protocols A and B
1 L glass beaker	Fisher Scientific	02-539P
1 L Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-368
25 mL Erlenmeyer Flasks	VWR international	89000-356	Protocol B
7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6431	Protocols A, B, and C1,C2
10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper	VWR international	VT6430	Protocol C2
Blue top tubes	Labco	438B
50 ml conical plastic tubes	Falcon BD	14-959-49A	All protocols
1.5 ml microfuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320	Protocols A and B
Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL)	BD Biosciences	301025, 301029, 301031	Protocols C1 and C2
25 gauge needles	Fisher Scientific	22-253-131	Protocols C1 and C2
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550	Protocol D
Pasteur pipettes	VWR international	14673-043	Protocol D
60mm Petri dishes	VWR international	25373-085	Protocol C
Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock	Custom Made		Protocol C
Optically transparent glass plate	Custom Made		Protocol C
Reacti-Vap III Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	18826	Protocol D
Cotton	VWR international	14224-516	Protocol D
High Vacuum Grease	Dow Corning	1597418	Protocol C1
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-18	Protocol B
Timer	ISC Bioexpress	T-2504-5	Protocol C
Gas-Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Protocol D
GC-MS	Hewlett-Packard	5980/5971	Protocol D
GC-MS	Agilent Technologies	6980N/5973N	Protocol D
HPLC	Varian Inc., Agilent	9010	Protocol D