פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Summary

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

Abstract

גישות גנטיות הפוך הוכיחו שימושי ביותר לקביעת אילו גנים בבסיס התנגדות לפתוגנים וקטור יתושים. פרוטוקול זה ממחיש וידאו שיטה המשמשת את המעבדה Dimopoulos להזריק לתוך dsRNA אנופלס gambiae יתושים, אשר בנמל טפיל המלריה. הטכניקה מניפולציה ההתקנה הזרקה והזרקת dsRNA לתוך החזה מודגם.

Protocol

RNAi בתיווך להשתקת גנים ב יתושים דורש הכנה מוקדמת של טיהור dsRNAs ספציפי כי היעד הגן של עניין. לסינתזה dsRNA, אנו ממליצים על ערכת Megascript Ambion אשר עושה שימוש T7-RNA פולימראז בתיווך בתגובה שעתוק במבחנה. עבור טיהור dsRNA, אנו ממליצים על ערכת RNeasy Qiagen. דוגמאות dsRNA יש לכמת והותאמו 3 מיקרוגרם / μL במים. חומרים אחרים תצטרך לכלול: קנס שקצהו מלקחיים, שקופיות זכוכית, מחטים זכוכית microcapillary, microinjector (אנו משתמשים Nanoject דראמונד השני), מיקרוסקופ אור רכוב מעל גוש קר, צלחת מכוסה פטרי מזכוכית, מגבות נייר דלי קרח . אתה גם צריך דרך לאסוף יתושים מיכל מתאים להם יחד עם מקור מזון כמו כדור צמר גפן טבול סוכרוז 10%.

1. איסוף יתושים שלך. שימוש aspirator סוללות, לאסוף את היתושים אתה רוצה להזריק. חברו את הפייה עם מגבת נייר או כותנה כך היתושים לא יכולים לברוח ולהסיר את המאגר. מאז בטמפרטורות קרות להרדים יתושים, לקבור את המאגר בתוך דלי של קרח לחכות 5-10 דקות עבור היתושים להפסיק לזוז. הרדמה יכול גם להיות מושגת על ידי הצבת המאגר בחדר מקרר או קר או באמצעות ה-CO _2. במהלך אלה 5-10 דקות, המשך לשלב הבא.
   
   
2. הכנת אזור העבודה שלך. הגדר בלוק משטח שטוח קר 2 ° C ו במקום שקופיות הזכוכית על זה. זה המקום שבו היתושים ינוחו כמו שאתה להזריק אותם. צרף מחט זכוכית אל microinjector ולהשתמש מלקחיים שלך לשבור את קצה המחט לרוחב הרצוי. חשוב הרוחב הוא גדול מספיק כדי לאפשר מספיק מקום נוזל לזרום בקצב סביר אך צר מספיק כדי לפצוע מינימלי במהלך ההזרקה. חוד המחט טוב יהיה צר מספיק כדי לכופף מעט אך לא להישבר. סט ציוד הזרקה שלך נפח את הפלט הרצוי (עבור RNAi, אנו משתמשים 69 NL). להטביע את קצה המחט לתוך המדגם שלך לצייר מדגם נוזל לתוך מחט באמצעות הוראות היצרן. דגימת נוזל יכול להיות פתרון dsRNA, השעיה חיידקי או אחרים; תהליך ההזרקה זהה עבור כל. הטמע צלחת פטרי זכוכית בדלי קרח כך התחתון של המנה לחלוטין פנייה קרח. זה המקום שבו תוכלו לשים יתושים עד שאתה מוכן להזרים אותם.
   
   
3. הכן יתושים שלך. 50-100 יתושים העברה מן המאגר כדי בצלחת פטרי מזכוכית. שימוש במלקחיים שלך דק אותם בשכבה אחת, מוודא ביותר במגע עם תחתית קר המנה לשמור אותם בהרדמה. מכסים אלה יתושים עם צלחת מכסה כאשר אינו בשימוש. חזור אל המאגר דלי הקרח כדי לשמור את שאר היתושים בהרדמה.
   
   
4. הר יתושים על גוש קר. השתמש מלקחיים קנס שקצהו שלך להעביר את היתושים אחד בכל פעם מצלחת לשקופית זכוכית רכוב על לחסום את הקור תחת מיקרוסקופ אור. גע בעדינות יתושים, רצוי על ידי הרגליים. הקו עד כ -30 יתושים Side-by-הצד בשקופית, כדי לוודא שאתה יכול להגיע כל אחד עם microinjector ולוודא שכל אחד יוצר קשר עם השקופית הקרה. ודא יתושים שלך מסודרים מסודר כך כמו שאתה הולך יחד אתה יודע שיש להם ואשר לא היה מוזרק. השאירו יתושים אחרים מכוסה בצלחת פטרי צונן.
   
   
5. הזרק הקבוצה הראשונה שלך של יתושים. החזק מלקחיים קנס שקצהו שלך היטה ביד אחת להחזיק את microinjector ביד אחרים כמו עיפרון. השתמש במלקחיים להעביר את יתוש כמו שאתה צריך (לטפל בהם על ידי הרגליים כדי למנוע פציעה) ולשמור היתוש יציב כמו שאתה מזריק. זה עובד הכי טוב אם משתמשים במלקחיים כדי לתמוך בצד אחד של יתוש כפי שאתה להזריק מהצד השני. בזהירות להכניס רק קצה מחט לתוך בית החזה של יתוש. עדיף להזריק לתוך חלק מתוח עדיין דקה של לציפורן כדי למזער את הפגיעה. כמו כן, להימנע הזרקת עמוק מדי, אתה רוצה רק קצה להיות בתוך בית החזה, זריקות לגרום לפצעים עמוקים יותר אשר תתפשר הישרדות. לאחר חוד המחט נמצאת בעמדה, לחץ ושחרר את דוושת הרגל של המנגנון microinjector אשר יספקו נפח שנקבע מראש שלך dsRNA. חכה שנייה או שתיים ומסירים את המחט מן היתוש. אם טיפה של נוזל מופיע מחוץ לאתר את הפצע, לחכות כמה שניות זה להיספג לתוך הפצע. אם זה לא לספוג תוך מספר שניות, להשליך כי יתושים ונסה שוב. המשך תהליך ההזרקה לכל יתושים בשקופית זכוכית שלך.
   
   
6. חנות יתושים שלך. כשתסיים, מקום יתושים מוזרק שלך בתוך מכולות שכותרתו (אנו מעדיפים 1 ליטר מצופה שעווה כוסות קרטון מכוסה על ידירשת רשתות מאובטחות עם גומיות מכסה הקרטון).
   
   
7. המשך זריקות עד המוגמר. המשך למקום יתושים בשקופית, להזריק ולהעביר כוסות עד שיש לך את גודל המדגם הרצוי לך. חשבון של כמה מקרי מוות, למתחילים יהיה יתושים רבים מתים הטראומה של הזרקה. זה ישפר עם התרגול עד כמעט 100% של יתושים שלך לשרוד זריקה.
   
   
8. בסיום, במקום מגבת מקופלת, נייר רטוב על כוס יחד עם מקור מזון לכסות את כוסות עם משהו כדי לשמור על לחות כגון בניילון נצמד או מכסה פלסטיק פטרי. יתושים מוזרק נוטים להתייבש כך את הלחות המסופקים על ידי מגבת רטובה שמורה בידי הפלסטיק יעזור למנוע זאת.
   
   
9. המקום יתושים שלך בתא מבוקרת לסביבה הדגירה.

הערה: יעילות של השתקת הגן משתנה מאוד ותלוי במספר גורמים, כולל תמליל וחלבון להתהפך שיעורי, יעילות ספיגת dsRNA על ידי תאים ואיברים. מצאנו כי ההשתקה מתחיל מוקדם ככל הזרקה 1 שלאחר יום, יכול להימשך עד 6 ימים שלאחר הזריקה. השתמש תמליל וחלבון שיטות זיהוי כגון PCR כמותי ומערב סופג כדי לאמת את ההשתקה.

הערה: יש כמה וריאציות על מספר שלבים של הזריקה יתושים RNAi בתיווך השתקת הגן טכניקה. כמה וריאציות מתוארים על ידי: Boisson, et al (2006) ו Blandin, et al (2002)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יעילות של השתקת הגן משתנה מאוד ותלוי במספר גורמים, כולל תמליל וחלבון להתהפך שיעורי, יעילות ספיגת dsRNA על ידי תאים ואיברים. מצאנו כי ההשתקה מתחיל מוקדם ככל 1 שלאחר הזרקת יום והוא יכול להימשך עד 6 ימים שלאחר הזריקה. השתמש תמליל וחלבון שיטות זיהוי כגון PCR כמותי ומערב סופג כדי לאמת את הה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond Scientific	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos