בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

Summary

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל ביעילות עבור ניתוחים תזרים cytometric.

Abstract

בידוד של תאים חיסוניים כי לחדור למערכת העצבים המרכזית (CNS) במהלך, אוטואימוניות זיהום, טראומה או ניוון מוחיים, נדרש לעתים קרובות להגדיר את הפנוטיפ שלהם פונקציות מפעיל. גישות Histochemical הם סייעה לקבוע את המיקום של התאים שחדרו ולנתח את מערכת העצבים המרכזית קשורה לפתולוגיה. עם זאת, ב-situ histochemistry וטכניקות צביעה immunofluorescent מוגבלים במספר נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בכל פעם בודד כדי לאפיין תת תא החיסון ברקמה מסוימת. לכן, גישות היסטולוגית יחד עם החיסון phenotyping ידי cytometry זרימה הם קריטיים לחלוטין לאפיין את ההרכב של חדירה למערכת העצבים המרכזית המקומית. פרוטוקול זה מבוסס על הפרדה של מערכת העצבים המרכזית השעיות הסלולר על discontinous percoll הדרגתיים. המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל באופן יעיל לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות של החיסון יחיד מדגם ידי cytometry הזרימה.

Protocol

הכנה של ריאגנטים

הכינו מלאי איזוטוני percoll (SIP), 4 מ"ל לכל המוח, על ידי ערבוב 9 חלקים percoll עם חלק אחד של 10X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +.

הכן SIP ב 70% 1X HBSS ללא Ca + + ו - Mg + +, 2 מ"ל לכל המוח לוותר לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל חרוטי.

הערה: מומלץ percoll יש להשתמש בטמפרטורת החדר, אם משתמשים בו קר, תאים נוטים גוש והפרדה התא הוא פחות יעיל.

רקמות איסוף homogenization

הרדימי עכברים perfuse דרך החדר השמאלי עם קרים כקרח HBSS 1X. לנתח את המוח ואת חוט השדרה ולשמור על RPMI ללא פנול אדום עד שכל העכברים מוקרבים.

רקמות מקום 7 או 15 מ"ל dounce homogenizer המכיל 3 מ"ל של RPMI, בעדינות לעשות השעיה תא עם העלי רפויים (גודל) ואחריו העלי Tigh צמודה (גודל ב ') כדי להמשיך לנתק את הרקמות. השלם את נפח של המתלים התא מ"ל 7 עם RPMI.

צבע להגדיר

הוסף 3 מ"ל של SIP כדי השעיית התא לבצע SIP 30% הסופי

לאט לאט שכבת ההשעיה תא 10 מ"ל על גבי SIP 70%. זהו השלב הקריטי ביותר של ההליך, השתמש פיפטה, סיוע להגדיר במצב כבידה למנוע ערבוב של 70% ו 30% פתרונות. קו שטוח מאוד ברור צריך להיות גלוי בצומת 70% -30%.

צנטריפוגה 30 דקות ב 500 גרם 18 ° C. ודא צנטריפוגות יפסיקו עם בלם מינימלית או לא, כך שלבי הביניים אינה מופרעת.

שימוש pipet העברה, בעדינות להסיר את השכבה של פסולת מהחלק העליון של הצינור ולאסוף 2.0-3.0 מ"ל של שלבי הביניים 70% -30% לתוך צינור חרוטי נקי המכיל 8 מ"ל של 1X HBSS. ודא percoll המכיל את שלבי הביניים הוא מדולל על פי שלוש, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך centrifugre ו 7 דקות ב 500 גרם ב 18 ° C.

Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של חיץ מכתים תא ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל לשטוף עוד פעם אחת באמצעות צנטריפוגות מיקרו ב 10,000 G 1 דקות ב 4 ° C.

נוגדן מכתים

כדורי Resuspend ב 50 μl של מטוהרים antimouse CD16/CD32 מדולל 1:200 במאגר מכתים התא כדי לחסום את אתרי הקישור Fc. לדגור על קרח למשך 10 דקות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.

הוסף 50 μl של שילוב נוגדן קוקטייל לדגור על קרח למשך 30 דקות. נוגדן כל חייב להיות טיטרציה הראשון להעריך דילול אופטימלי. השתמש שילובים fluorochrome המתאים נבחר על פי היכולות של לייזר הגדרות המסנן של cytometer תזרים הספציפית שלך.

שטפו תאים חיץ תא מכתים, כדורי resuspend ב μl 100-200 של חיץ מכתים תא ולנתח מיד cytometer, או לחילופין תאים ניתן resuspended paraformaldehyde ב 2% (PFA) שהוכנו PBS ומאוחסנים יתר בלילה 4 ° C .

נציג תוצאות:

אחרי סיבוב הדרגתיים, את שלבי הביניים 70% -30% צריך הילה לבנה מוגדר, quantitation של תאים התאושש עכבר תמים צריך להניב 3-5 x10 ⁵ תאים לכל עכבר (המוח וחוט השדרה ועוד). דלקת המוח אולי החל מספרים של תאים דלקתיים בהתאם העלבון CNS או מודל המחלה (איור 1).

באיור 1. בידוד של תאים mononuclear, מן תמים EAE מוח על המחלה שיא. תאים השעיות המוח הופרדו על רציפות 70% / 30% percoll הדרגתיים. מוכתם תאים הודגרו עם FC-לחסום ואחריו אנטי CD45 נוגדנים למשך 30 דקות על הקרח. תאים שהיו שטופים במאגר מכתים התא קבוע ברכישת PFA 2% מוקדם LSR-II. CD45 העוצמה נמדדת על ציר Y, ​​כאשר שלוש האוכלוסיות ברורים הם דמיינו. אפיון נוסף של פנוטיפ החיסונית של CD45 בתאי ^היי חדירה מיושמת באמצעות נוגדנים נוספים ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניתוח של השטח סמנים תא leukocytes CNS מרקמות עכבר רגיל מודלק נוצל במשך כמה עשורים ^1-3. פרוטוקולים בידוד מבוססים הפרדת microglia ו leukocytes ידי ⁴ צנטריפוגה צפיפות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה של בידוד CNS leukocytes באמצעות רציפה הדרגתיים percoll. אחרי בידוד של תאים, צביעה עם נו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials