רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

Summary

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן ב לשעבר vivo התרבות של לימפוציטים-B הטחול מתואר. שיטה זו מנצלת את ייצור רקומביננטי retroviral ב חופשית עוזר, קו אריזה ecotrophic התא. יציבה, תורשתי הביטוי של הגן של עניין בתוך לימפוציטים העיקרית היא להשיג מוביל לדור של נוגדנים על פני תאים B עוברת לעבור רקומבינציה בכיתה.

Abstract

הביטוי מהונדס של גנים בתאים אוקריוטים היא גישה חזקה גנטית הפוכה שבה הגן של עניין מתבטא בשליטה של ​​מערכת ביטוי Heterologous כדי להקל על ניתוח של פנוטיפ שהתקבל. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן כי לא נמצא בדרך כלל האורגניזם, להביע את טופס מוטציה של מוצר הגן, או יתר להביע בצורה דומיננטית שלילית של המוצר גן. זה שימושי במיוחד במחקר של מערכת hematopoetic, שבה תקנה תעתיק הוא מנגנון בקרה מרכזי בהתפתחות והתמיינות של תאים B ^1, הנסקרת ב ^2-4.

עכבר הגנטיקה הוא כלי רב עוצמה ללימוד גנים מחלות אנושיות. ניתוח השוואתי של העכבר הגנום האנושי מגלה שימור synteny של מעל 90% של הגנום ^5. כמו כן, רוב הטכנולוגיה שבה נעשה שימוש במודלים של העכבר הוא ישים בחקר הגנים האנושיים, למשל, שיבושים גנים החלפת allelic ⁶ . עם זאת, יצירה של עכבר מהונדס דורש מידה רבה של משאבי הטבע הן כספי וטכני. מספר פרויקטים כבר החלו לאסוף ספריות של לדפוק את זני העכבר (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) או mutagenesis זנים המושרה (RIKEN), אשר דורשים בקנה מידה גדול מאמצים ושיתוף פעולה ^7. לכן, רצוי קודם ללמוד את הפנוטיפ של הגן הרצוי במודל התא התרבות של תאים ראשוניים לפני שממשיך במודל של עכברים.

ה-DNA retroviral משתלב ה-DNA המארח, רצוי בתוך או ליד יחידות שעתוק או איים CPG, והתוצאה היא יציבה תורשתי הביטוי של הגן ארוז עניין תוך הימנעות השתקה תעתיק ^{8 9.} הגנים מתועתקים אז בשליטת מקדם יעילות גבוהה retroviral, וכתוצאה מכך יעילות גבוהה של שעתוק וייצור חלבונים. לכן, הביטוי retroviral ניתן להשתמש בתאים שקשה transfect, ובלבד התאים נמצאים במצב פעיל במהלך מיטוזה. מכיוון גנים מבניים של הנגיף נמצאים בתוך הקו תא אריזה, וקטורים ביטוי בשימוש לשבט את הגן של עניין אינם מכילים גנים מבניים של הנגיף, אשר שניהם מבטלת את האפשרות של revertants ויראלי מגביר את בטיחות של עבודה עם supernatants ויראלי כמו virions לא זיהומיות מיוצרים ^10.

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקומביננטי retroviral זיהום הבאות של תאים B הטחול. לאחר הבידוד, התאים בתרבית הם הטחול מגורה עם lymphokines נגזר ה 'אנטי CD40, אשר מעוררת פרץ של התפשטות תאים B ו בידול ^11. פרוטוקול זה הוא אידיאלי ללימוד אירועים המתרחשים מאוחר בהתפתחות התא B ו בידול, כמו תאים B מבודדים הטחול בעקבות האירועים hematopoetic הראשונית אבל לפני גירוי antigenic להשרות התמיינות plasmacytic.

Protocol

1. בידוד הטחול B-לימפוציטים וגירוי

1. קציר spleens מתרומת זרע מחסר עכברים ¹² בין 2-3 חודשים של גיל. הבידוד של הטחול מבוצעת בתנאים סטריליים האיברים נשמרים באופן זמני מלוחים למאגר קר פוספט (PBS) המכילה 15% נסיוב עוברי שור (FBS).
2. הטחול הוא הועבר לאחר מכן ברדס רקמה סטרילית תרבות הומוגני ב 5 מ"ל של PBS FBS בתוספת 2.5%. מעבירים את homogenate אל צינור בז 15 מ"ל.
3. צנטריפוגה מדגם הומוגני רקמת הטחול ב 1000rpm במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
4. למזוג supernatant לאחר צנטריפוגה. Resuspend התא גלולה בתא 10 מ"ל דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות, כדי למנוע זיהום על ידי כדוריות דם אדומות.
5. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות ו supernatant למזוג ו resuspend התאים המכיל 10 מ"ל PBS 2.5% FBS.
6. הסר 100 aliquot μL ולספור את התאים בדילול 1:1000 באמצעות hemacytometer תקן באמצעות trypan כחול להוציא את כל התאים המתים. כ 2-30 תאים ניתן להשיג בכל הטחול.
7. צנטריפוגה מדגם ב 1000rpm במשך 10 דקות למזוג supernatant.
8. Resuspend גלולה ב -0.5% BSA / PBS המכיל 2mm EDTA בריכוז של 10 ⁷ תאים לכל μL 90.
9. הוסף אנטי CD43 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים על התאים במיוחד כדי לאגד הלא B תאים. השתמש 10 חרוזים μL לכל μL 90 (10 ⁷ תאים). מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
10. ברגע שתאי סומנו בתווית, לשטוף אותם על ידי הוספת 2.5% FBS / PBS על גבי הצינור. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות.
11. למזוג supernatant. Resuspend התאים 0.1% BSA / PBS בריכוז של 10x10 ⁷ תאים לכל מיליליטר.
12. הר טור מיון מגנטי על מפריד מגנטי. מיקום צינור חרוטי ישירות מתחת בעמודה לאסוף את הזרימה דרך לטעון את הטור עם 0.5% 3mL BSA / PBS על הממשלה ולשטוף.
13. לאחר נוזלים יש לשטוף זרמו, להחליף עם צינור אוסף חדש. אם המדגם הוא פחות מ 1 מ"ל, להתאים את עוצמת הקול מדגם מ"ל 1 עם 0.5% BSA / PBS / EDTA עומס המדגם בעמודה. טען רק 1 מ"ל המרבי של תאים לכל עמודה ולהשתמש עמודות מרובות במידת הצורך.
14. אפשר התאים פסיבי לזרום דרך העמודה לאסוף את התאים מאוגד בצינור חרוטי תחת העמודה. לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 3 מ"ל 0.5% BSA / PBS תוך כדי לאסוף את הזרימה דרך.
15. לאסוף את כל זרימה דרך שבה CD43 בתאי B שלילי מנוחה יהיה מועשר. מחק את העמודה. צנטריפוגה זרימה דרך בסל"ד 1000 למשך 10 דקות.
16. מסננים את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל בינוני (15% FCS / + גלוטמין, פן / סטרפטוקוקוס, שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרומטר Β-ME)
17. ספירת התאים והתרבות 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.
18. כדי להמריץ את הצמיחה התפשטות תאים B ו, במוסף בינוני עם נוגדן רקומביננטי IL-4 ו אנטי CD40 כזה הריכוזים הסופיים 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות.
19. התרבות התאים לילה. ספירת תאים ו לדלל עד 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר, והוסיף IL-4 ו CD40 על פי הצורך.
20. התרבות התאים למשך 72 שעות לפני זיהום ויראלי.

2. Transfection של תאים מפיק

שימוש בפרוטוקולים הוקמה עבור transfection או באמצעות קטיוני שומנים או סידן פוספט. Transfect ³ צלחת 10 ס"מ לכל לבנות DNA, באמצעות 100 מיקרוגרם פלסמיד דנ"א לכל צלחת. אנו משתמשים באופן שגרתי סידן פוספט transfection שיטה ^{13, 14} ו - לב titer ויראלי גבוה, כאשר בתוספת chloroquine.

1. השתמש ב 60% -70% תאים ומחוברות פיניקס כמו תאים המפיק להיות transfected. בספירה זו צריך להיות מפגש תא 5,000,000 תאים לכל צלחת 10 ס"מ.
2. שעה אחת לפני transfection, להחליף את התקשורת עם התקשורת להשלים טרי צמיחת תאים פיניקס.
3. בתוך צינור eppendorpf סטרילי, לשלב 100 מיקרוגרם של אריזות לבנות DNA, 250 μL של CaCl ₂ 0.5m, ולהתאים את עוצמת הקול הסופי μL 500 עם מים סטריליים
4. בעזרת פיפטה 1 מ"ל, במרץ לערבב את הפתרון הזה עם HNP 500 2X μL בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל
5. תערובת זו אפשר לנוח בטמפרטורת החדר למשך 80-10 דקות. במהלך תקופה זו משקע יהוו.
6. מוסיפים את תערובת transfection ירידה מבחינת אל התאים בעוד מתערבל המדיום כדי לפזר באופן שווה את התערובת לאורך.
7. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
8. 12 שעות לאחר transfection, להחליף את תא בינוני עם 8ml להשלים בינוני B הצמיחה ולהחזיר את התאים ל 37 ° C חממה.

3. זיהום של מגורה תאים B הטחול

1. הסר supernatant מתאי פיניקס 48hr שלאחר transfection ולהעביר את supernatant דרך 0.2 מיקרון המסנן כדי להסיר כל פסולת התא.
2. מערבבים 3 מ"ל של נגיף המכיל supernatant עם 3 מ"ל של טרום הפעלת תאים B (כמו שלב 1). כדי לשפר את ספיחה נגיפי אל התאים, להוסיף polybrene בריכוז סופי של 16 מיקרוגרם לכל מ"ל.
3. להדביק את התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 90 דקות בקצב של 30 ° C.
4. מיד לאחר הסחיטה, דגירה למשך 48-72 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר גדילת התא התפוצה.

4. Cytometry זרימה ניתוח

1. שימוש cytometer זרימה, לנתח את התאים לביטוי פני השטח של IgG1 B220 ו - פני השטח. הנוכחות של IgG1 על פני השטח של התאים עולה כי הבורר רקומבינציה בכיתה אירעה כתוצאה חילוץ מוצלח באמצעות השלמה retroviral של הגן AID.

5. נציג תוצאות

יש לנו להציל בהצלחה מחסור של חלבון גורם דאמינז הפעלה Cytidine מושרה (AID) מתרומת זרע מחסר (AID-/ -) לימפוציטים-B באמצעות התמרה retroviral. בקצרה, אנחנו שנוצר רטרווירוסים רקומביננטי להביע AID העכבר (המשרתת) חלבון ידי transfecting תאים פיניקס עם PMX-GFP משרתת ^15-18. וירוסים שנקטפו היו נגועים לתוך AID מחסר בתאי B המתקבל AID מחסר עכברים רקומבינציה לשעבר vivo בכיתה מתג (CSR) התנאים גירוי ^19. התאים הנגועים ב נותחו לאחר מכן עבור אל CSR IgG1 לאחר 72hrs בתרבות באמצעות ניתוח תזרים cytometry. איור 2 מציג את הזיהוי של IgG1 על פני השטח של תאים B עם תרומת זרע, אך לא לבנות ריק, המציין כי CSR אירעה כתוצאה הצלה ביטוי AID.

איור 1: תוכנית של אריזות retroviral בתוך התאים מפיק: Gene של עניין, המיוצגים על ידי Ψ, היה subcloned לתוך PMX-IRES-GFP, כפי שתואר לעיל ^15. הפלסמיד היה transfected לתוך קו אריזה ecotropic ויראלי תא מסוגל לייצר איסור הפרסום-pol וחלבון המעטפה (פניקס, Orbigen), באמצעות שיטת סידן פוספט ^{13, 14.} ארבעים ושמונה שעות לאחר transfection, supernatant חלקיקים נגיפיים המכיל נאסף על זיהום לתוך היעד העיקרי בתאי B שהתקבלו בעכברים.

איור 2: חסר AID תאים B, מגורה עם אנטי CD40 ו - IL-4 נדבקו רטרווירוס המכיל PMX-GFP משרתת או רטרווירוס להביע GFP לבד. רמת אחריות חברתית כדי IgG1 הוערך על ידי ניתוח FACS.

Discussion

התמרה retroviral של תאים B הטחול כפי שתואר כאן, כמתואר באיור 1 היא גישה גנטית שימושי במחקר של לימפוציטים-B כי רבים מן האירועים התפתחותיים lymphopoesis נשלטים על ידי תקנה תעתיק ^{1, 2.} בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות תא B, מפעילה באמצעות CD40L חיוני לזירוז הצמיחה תא B, הכניס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FCS	Atlanta Biologicals	S11550
RPMI	Invitrogen	22400
PBS	Invitrogen	20012
Red Blood Cell (RBC) lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
CD43 beads	Miltenyi Biotec
B Cell Complete Media	Various	Various Components	RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol
IL-4
Anti-CD40	BD Biosciences	553787
polybrene	Sigma-Aldrich	107689
Chloroquine diphosphate salt	Sigma-Aldrich	C6628	Used at 100mM
Ph–nix Eco cells (Murine)	Orbigen	RVC-10002
PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220)	eBioscience	15-0452-81
PE-α-mouse-IgG1	BD Biosciences	A85-1