אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

Summary

פרוטוקול יעיל עבור לשעבר vivo התפשטות של הגידול ותאי T-reactive מן הגידול ניקוז בלוטות הלימפה או אחרות ברקמות הלימפה משני נושאות גידולים המארחים מתואר. פרוטוקול זה מרחיב סלקטיבי גידולים ספציפיים בתאי T לשימוש חיסוני המאמצת של סרטן השד.

Abstract

נמסר כי חולי סרטן השד יש קיימים התגובות החיסוניות נגד גידולים ^1,2 שלהם. עם זאת, התגובה החיסונית כאלה אינן מספקות הגנה מלאה מפני התפתחות או הישנות סרטן השד. כדי להתגבר על הבעיה על ידי הגדלת תדירות הגידול-reactive בתאי T, חיסוני המאמצת הועסק. מגוון של פרוטוקולי שימשו להרחבת גידול ספציפי בתאי T. פרוטוקולים אלה, לעומת זאת, מוגבלים לשימוש vivo אנטיגנים סרטניים לשעבר להפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. ממש לאחרונה, נפוץ שרשרת גאמא ציטוקינים כגון IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 שימשו לבד או בשילוב להגברת אנטי הגידול התגובה החיסונית ^3. עם זאת, לא ברור מה ניסוח יעבוד בצורה הטובה ביותר להרחבת הגידול ותאי T-reactive. כאן אנו מציגים פרוטוקול להפעלת סלקטיבית והרחבת הגידול ותאי T-reactive ממודל FVBN202 עכבר מהונדס של סרטן שד חיובי HER-2/neu לשימוש בטיפול T המאמצת התא של סרטן השד. הפרוטוקול כולל הפעלה של תאים T עם bryostatin-1/ionomycin (B / I) IL-2 בהעדר אנטיגנים סרטניים במשך 16 שעות. B / הפעלה אני מחקה אותות תאיים כי התוצאה הפעלת תא T על ידי הגדלת הפעילות חלבון kinase C, סידן תוך תאי, בהתאמה ^4. פרוטוקול זה במיוחד הגידול מפעיל ספציפי בתאי T תוך הרג ותאי T לא רלוונטי. B / אני המופעל בתאי T הם מתורבתים עם IL-7 ו - IL-15 במשך 24 שעות ו פעמו אז עם IL-2. לאחר 24 שעות, ותאי T נשטפים, מפוצל, ותרבותיים עם IL-7 + IL-15 במשך 4 ימים נוספים. יעילות הגידול סגוליות ואנטי גידול של ex vivo תאים מורחבת T נקבע.

Protocol

1. בידוד של לימפוציטים ⁵

1. בודד הגידול ניקוז בלוטות הלימפה או spleens מן הגידול נושאות FVBN202 העכברים הטרנסגניים ולהכין ההשעיה תא יחיד קר כקרח RPMI1640 בתוספת 10% FBS. B / אני ההפעלה של 50 מ"ל פוליפרופילן תוצאות צינורות חרוטי בתשואה טי תא גדול לעומת צינורות קלקר. קטמין ו Xylazine מוזרקים ip עבור הרדמה. פריקה צוואר הרחם משמש כשיטה של ​​המתת חסד.
2. התרבות התאים (10 ⁶ תאים / מ"ל) ב בינוני מלא המכיל 15% FBS עם bryostatin-1 (5 ננומטר) ionomycin (1 מיקרומטר) יחד עם 80 U / mL של IL-2 (Peprotech) עבור 16 ח
3. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם המדיום חמים (37 מעלות צלזיוס) והתרבות 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום להשלים עם IL-7 (10 ng / mL) ו-IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) עבור 24 שעות .
4. דופק את התאים עם IL-2 (40 U / mL) במשך 24 ח
5. פיצול תאים והתרבות אותם עם IL-7 ו - IL-15 (10 ng / mL) במשך 4 ימים נוספים. שנה בינונית לפצל את התאים אם יש צורך כל 2 ימים.

2. קביעת הרחבת מקפלים של תאים T על ידי ספירת תאים cytometry זרימה ניתוח ⁵

1. Cell נחשב על ידי מיקרוסקופ אור
   1. הכן דילול התא המתאים (1:100) ב trypan כחול ולהוסיף כמה μL על hemocytometer
   2. הרוזן 9 ריבועים לקבוע מספר תאים על ידי חלוקת סך ספירת תא למספר תאים כפול פקטור התימהול. התוצאות יציג מספר x 10 ⁴ תאים / מ"ל.
2. קביעת שיעור CD8 + CD4 + ו ותאי T בתאי מורחבת על ידי זרימת cytometry
   1. בלוק הלא ספציפית מחייב של נוגדנים לקולטנים על ידי Fc culturing התאים עם הנוגדנים anti-CD16/CD32 (Biolegend) במשך 20 דקות על הקרח ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS בתוספת אזיד הנתרן 1% .
   2. הכתם התאים על ידי culturing עם FITC-CD4 ו PE-CD8 נוגדנים עבור 20 דקות על הקרח ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS בתוספת 1% ו FBS אזיד הנתרן 0.1%.
   3. תקן את התאים paraformaldehyde 1% ולהפעיל דגימות על Beckman Coulter FC 500 ולנתח בעזרת גרסה 4.3 Summit תוכנה.

3. קביעת גידולים הספציפיות של Vivo לשעבר מורחבת תאים T

1. תרבות vivo לשעבר מורחבת הלימפוציטים בינוני מלא ביחס 10:01 עם מוקרן Neu תאים סרטניים חיובי MMC (15,000 rad) עבור 24 ח ⁵
2. קציר supernatants ולאחסן ב -80 ° C עד בשימוש. ^5,6
3. זיהוי IFN-γ באמצעות עכבר IFN-γ ELISA הגדר (BD Pharmingen) על פי פרוטוקול של היצרן. ^5,6

4. קביעה אנטי סרטניים פונקציה של Vivo תאים לשעבר מורחבת T ^5,6

1. דגירה T תאים עם תאים סרטניים 10:01 מפעיל: יחסי יעד 48 שעות להשלים בינוני בבית בינוני 3 מ"ל מלאה (RPMI-1640 בתוספת 100U / mL של פניצילין, 100μg / סטרפטומיצין מ"ל, 10% FBS, גלוטמין ו - β - mercaptoethanol) ו 20U / mL של IL-2 (Peprotech) ב 6 מנות התרבות גם CO 37 ° C / 5% _2.
2. לבצע שלוש נוגדן צבע מכתים עבור Neu (anti-c-Erb2/c-neu, לשבט-4, Calbiochem) ואחריו PE-אנטי עכבר IgG, Annexin V-FITC ו יודיד Propidium (PI) על פי פרוטוקול של היצרן (BD Pharmingen)
3. שער על תאים סרטניים Neu חיובי וניתוח כדאיות (Annexin V-/PI-) של תאים סרטניים

5. עכבר דגם של סרטן השד

FVBN202 נקבות העכברים הטרנסגניים (Charles River Laboratories) יכול לשמש מקור הגידול בתאי T-reactive. עכברים אלו overexpress עכברוש לא ממושכת Neu transgene לפי תקנה של האמרגן MMTV וכתוצאה מכך לפתח סרטן השד ספונטנית בין 4-10 חודשים של גיל ^7. עכברים אלו לפתח היפרפלזיה החלב טרום ממאיר דומה קרצינומה ductal באתרם (DCIS) לפני התפתחות carcinoma8 ספונטנית. ספונטנית נושאות גידולים בעכברים המשמשים התורמים של תאים T.

6. נציג תוצאות:

הפעלה של תאים עם T / B אני במשך 16 שעות התוצאות בהרג של תמימים בתאי T, כי הם לא רגישים עם הגידול in vivo. לאחר סלקטיביות B / אני הגידול ותאי T-reactive הם להרחיב עד 2.8 פי בתרבות 6 ימים עם שרשרת גאמא ציטוקינים (איור 1). שני CD8 + CD4 + ו ותאי T מורחבות באופן שווה עם שרשרת גאמא ציטוקינים (איור 2). Ex-vivo מורחבת בתאי T להראות היענות גבוהה נגד גידולים בעכברים כי התורם היו רגישים, כפי מוערך על ידי ייצור של IFN-γ בנוכחות קרצינומה של העכבר Neu חיובי החלב (MMC) תאים סרטניים (איור 3). Vivo לשעבר מורחבת בתאי T יכול לגרום אפופטוזיס של cel חיובי הגידול MMC Neuls כדאיות כזו של תאים סרטניים טיפות של% 92 עד% 61 בתוך 48 שעות (איור 4).

באיור 1. התרחבות מקפלים של לימפוציטים בנקודות זמן שונות לאחר הפעלת B / אני (יום 1) והרחבת vivo לשעבר עם ציטוקינים שרשרת גאמא (יום 3, 5 ו 7)

איור 2. האחוז הכולל של CD4 + ו - CD8 + T תאים לפני ואחרי הרחבת 7 ימים עם ציטוקינים שרשרת גאמא.

איור 3. גידולים מגורה IFN-γ הייצור על ידי בתאי T שבודדו נושאות גידולים בעכברים לפני ואחרי הרחבת 7 ימים עם ציטוקינים שרשרת גאמא, באמצעות IFN-γ ELISA

איור 4. לתפקד ציטוטוקסיות של vivo לשעבר מורחבת בתאי T עם שרשרת גאמא ציטוקינים נגד קרצינומה של העכבר Neu חיובי החלב (MMC) תאים סרטניים

Discussion

הרחבת סלקטיבי של גידולים בתאי T-reactive עם פונקציה אנטי הגידול מפעיל יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בפרוטוקול המוצע B / אני הפעלה והרחבה vivo לשעבר עם שרשרת גאמא ציטוקינים IL-2, IL-7 ו IL-15. בעוד IL-2 הוא תא T גורם הצמיחה שיכול לתמוך הבידול וההתרחבות של אנטיגן ספציפי בתאי T, IL-7 י?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175