Microdissection של האלמנה השחורה עכביש המשי לייצור בלוטות

Summary

כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה להסיר את משי לייצור בלוטות מהבטן של הנקבה עכבישים אלמנה שחורה. הליך זה מאפשר בידוד מהיר של משי לייצור שבע ברורים בלוטות באופן מטוהרים, תהליך חשוב עבור החוקרים ללמוד ייצור והרכבה עכביש המשי סיבים.

Abstract

עכבישים מודרנית ספין ביצועים גבוהים סיבי משי עם מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים, כולל ללכוד, טרף תנועה והגנה על פיתוח ^1,2 צאצאים. עכבישים לבצע משימות אלה על ידי ספינינג כמה סוגי סיבים שונים שיש להם תכונות מכניות שונות. התמחות כזו של סוגי סיבים אירעה דרך באבולוציה של משי בלוטות ייצור שונות, אשר לתפקד biofactories קטן. אלה מייצרים biofactories ולאחסן כמויות גדולות של חלבונים משי לייצור סיבים. באמצעות סדרה מורכבת של אירועים ביוכימיים, חלבונים אלה משי מומרים מנוזל לחומר מוצק על שחול.

מחקרים הוכיחו כי מכונות משי עכביש חזקים יותר מפלדה גבוהה מתיחה ^3. ניתוח להבין את הקשר בין המבנה והתפקוד של הנושאים עכביש המשי חשפו כי קורי עכביש מורכב בעיקרו של חלבונים, או fibroins, כי יש לחסום חוזר בתוך רצפי חלבונים שלהם ^4. חתימות מולקולרית נפוצים התורמים לחוזק מתיחה מדהימה הרחבה של משי עכביש נמצאים פרומים דרך ניתוח cDNAs משי המתורגם. בהינתן מאפייני החומר יוצא דופן של עכביש המשי, מעבדות מחקר ברחבי העולם מתחרים להבין לחקות את תהליך ספינינג לייצר סיבי משי סינתטי עבור יישומים מסחריים, צבאיים ותעשייתיים. אחד האתגרים העיקריים ספינינג קורי עכביש מלאכותיים במעבדה מחקר כרוך הבנה מלאה של התהליכים הביוכימיים המתרחשים במהלך שחול של סיבי המשי לייצור בלוטות.

כאן אנו מציגים שיטה הבידוד של שבע משי לייצור שונים מן הבלוטות cobweaving עכביש האלמנה השחורה, הכוללת את בלוטות ampullate ראשיות ומשניות [מייצרת גרר ופיגומים משי] ^5,6, tubuliform [במקרה מסנתז משי ביצה] ^{7 , 8,} flagelliform [פונקציה ידוע קלח-אורגים], במצטבר [עושה משי דבק], aciniform [מסנתז גלישת טרף במקרה האשכולות ביצה] ⁹ ו pyriform [מייצרת משי מצורף דיסק] ^10. גישה זו מבוססת על הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן, ההפרדה הבאות של cephalothorax מן הבטן, והוא microdissection של הבטן כדי להשיג את משי לייצור בלוטות. בעקבות ההפרדה של משי לייצור בלוטות שונות, רקמות אלה ניתן להשתמש כדי לאחזר מקרומולקולות ביוכימיים שונים עבור ניתוחים שונים, כולל כמותי בזמן אמת PCR, הצפוני והמערבי סופג, ספקטרומטריית מסה (MS או MS / MS) מנתח לזהות חדש רצפי חלבון משי, לחפש חלבונים להשתתף במסלול הרכבה משי, או להשתמש רקמות שלמות על תרבית תאים או ניסויים היסטולוגית.

Protocol

1. הרדמה העכביש ובידוד של הבטן

1. העברת העכביש מתוך צנצנת זכוכית לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק (איור 1 א). בדרך כלל אנו אוספים עכבישים מ גזעים, מוסכים או שיחים הבית אותם במעבדה בצנצנות זכוכית. בגלל העכביש לא יכול לטפס את יריעת הניילון, הוא מספק שיטה יעילה להעביר את העכביש מתוך צנצנת זכוכית או קפה יכולים לתוך בקבוקון קטן לצורכי הרדמה. בעוד הטיפול עכביש בשלב זה, אתה צריך ללבוש שני זוגות של כפפות גומי, או כפפות גינון למטרות בטיחות.
2. בעוד עכביש הוא בתיבה מצופה פלסטיק, הגישה עכביש מהישבן שלה ולתת את השקופית עכביש לתוך הבקבוקון תרבות הפלסטיק. לאחר שהעכביש נכנס הבקבוקון, מיד במקום תקע מעל (איור 1B). אנו ממליצים להשתמש בקבוקון כי הוא כ 101.6 מ"מ x 31.75 מ"מ (אורך x D). זו מקטינה את כמות הגז פחמן דו חמצני הדרוש לשלב הרדמה.
3. להרדים את העכביש על ידי החדרת גז דו תחמוצת הפחמן ב 5-10 פאונד לאינץ' מרובע דקות 10 (תרשים 1C). זו כמות הגז רק לדפוק את העכביש החוצה סביב 5 דקות, אז לאחר הרדמה אתה חייב להמשיך מיד צעדים 1.4-1.5.
4. מניחים את עכביש מרדים לתוך צלחת לנתיחה קטנים להשתמש במלקחיים כדי למקם את הצד הגבי עכביש מעלה (שעון חול אדום פונה כלפי מטה).
5. קליפ (גבעול צר המחבר את cephalothorax ואת הבטן) pedicel לשחרר את הבטן משאר העכביש (1D איור). חנות cephalothorax במקפיא לילה בצלחת פטרי וזורקים לאחר קפוא למחרת. היזהר בעת הזזת cephalothorax כמו ניבים של העכביש נמצאים על מגזר זה.
6. הדקו את הבטן לחומר Sylgard בצלחת לנתיחה קטנים באמצעות סיכה חרק אחד. הכנס את הסיכה חרקים דרך החור עשוי לקצץ את pedicel (איור 1E). זה יכול בקלות להיות מזוהה כאתר שבו הנוזל הוא העולה מתוך גזיר של pedicel. ודא spinneret (סוף היפוכו של pedicel) מכוונת כלפי מטה (קרוב אליך).

2. הסרת שלד חיצוני

1. הפוך את החתך הראשון באמצעות שלד באמצעות זוג microscissors, החל החור מגזיר pedicel. גזור רוחבית עד הצד הגבי הוא הגיע משני הצדדים (איור 1F). בעזרת זוג מלקחיים, לקלף קטע האחורי שלד הקדמי והכנס סיכה השני במיקום זה. בעקבות הכניסה של סיכה השנייה, להפוך את מגש לנתח caudally (90 ° זווית) של חתכים לרוחב הראשוני ולהמשיך חיתוך עד spinnerets הם הגיעו (איור 1G). חתך זה יהיה מאונך או אנכי לחתוך לרוחב הראשונית. אין לחתוך את spinnerets כאשר חתך אנכי מורכב (יחסית האחורי אל שעון החול ויש לה מראה עגולה). אי להכניס את הסיכה השני יהיה תוצאה בבטן ספינינג כאשר חתכים אנכיים מבוצעות.
2. הבטן טבול לנתח פתרון חיץ (0.1 מ כלוריד נתרן, 0.015 ציטראט M נתרן, 0.1% Diethyl Pyrocarbonate).
3. פיל שלד הנותרים בחזרה החל החתך, הראשונית לרוחב. כאשר זו תושלם, רקמת שומן צריך להיות נראה בבירור (איור 1H).

3. בידוד של משי לייצור בלוטות

1. מלקחיים שימוש להתחיל מתגרה ממנו את שכבת השומן (איור 1H). השומן יהיה לבנבן למראה צהבהב. המשך עד שרוב השומן הוא להסיר את בלוטות משי גלויים לעין. בלוטת tubuliform מורכב משלושה זוגות, צינורות גליליים ארוכים מאוד, כי הם בשפע בחלל הבטן. Ampullate הגדולות, אשר נמצא בזוגות, הוא ampulla גדול, בצורת חצי סהר עם זנב ארוך דיסטלי מפותלים צינור הפרוקסימלי כי ירידה רוחב כפי גישות spinnerets של עכביש. Ampullate קטין דומה מאוד מורפולוגיה כדי ampullate העיקרי, אבל הוא קטן יותר באופן משמעותי. בלוטת flagelliform, גם המתרחשים בזוגות, הוא עגול multilobular עם גלילי קטן זיג זג צינור המשתרע לעבר spinnerets. בלוטת המצרפי (נמצא בזוגות) הוא גדול מאוד, בלוטת multilobular כי יש צינור ההפרשה גדול מאוד אשר גדול, אונות סדיר על זה. בלוטות aciniform להתרחש במספרים גדולים ומזכירים קצר, תחזיות אצבע קטנה. בלוטת pyriform היא בלוטה קטנה בבטן יש הרבה נדחס, צינורות גליליים המזכירים מאוורר עם הרבה צינורות הפרשה קטנה להאריך עד spinnerets.
2. אנו ממליצים על הסרת בלוטות לפי הסדר הבא: tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, צבירה, aciniform, ואז pyriform (איור 2A-B).
3. החל tubuliform, להקניט את בלוטות אלה של שאר הבלוטות דואר - הם צריכים להיות יושב על גבי בלוטות אחרות (איור 2 א). ישנם שלושה זוגות של בלוטות tubuliform עכביש בודד. לאפשר להם לצוף חופשי אבל להישאר מחובר spinnerets שלהם על ידי צינורות שלהם.
4. בשלב הבא, להקניט משם בלוטות ampullate הגדולות. ישנן שתי בלוטות ampullate העיקריים נוכח עכביש אחד. במהלך הליך ההסרה, לוודא הצינורות נשארים מחוברים בלוטות (איור 2 א).
5. המשך להקניט את שאר הבלוטות אחד מהשני, עובדים בזהירות כדי למנוע ניקוב של כל הבלוטות, בעיקר המצרפי בלוטות flagelliform. בלוטת כל צריך להיות חופשי צף כל הדרך אל נקודת היציאה שלה שלד ועד spinnerets. בלוטות אלה מצויים גם בזוגות. הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה. Ampullate הגדולות, flagelliform, ampullate קטין, ובלוטות המצרפי נמצאים בזוגות. בלוטות aciniform ו pyriform להתרחש זוגות רבים נוספים.
6. הסר כל על ידי בלוטת צובט את צינור עם מלקחיים ובזהירות למשוך אותו עד שזה נשבר הרחק מנקודת היציאה על ידי spinneret. אנחנו בדרך כלל לאחסן בלוטות הרטובה, עם זאת, אנחנו לא להוסיף למאגר נוספים.
7. כמו בלוטות יוסרו, למקם אותם לתוך סטרילי מראש שכותרתו 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. בלוטות הפרט מוצגים באיור 3A-G. זכור את בלוטות על הקרח ואז פלאש להקפיא אותם בחנקן נוזלי. בעקבות הקפאת פלאש בחנקן נוזלי, למקם אותם בבית -80 ° C לאחסון.

4. נציג תוצאות

לאחר הסרת בלוטות שונות, זהירות קיצוניים צריך לקחת בזמן הטיפול flagelliform ובלוטות צבירה, כמו אלה שני מבנים ניתן ניקב בקלות פגום עם מלקחיים. יתר על כן, ראוי לציין כי מורפולוגית בלוטות flagelliform ו המצרפי נראים דומים מאוד לפני הסרת שלהם והם שזורים זה בזה לעתים קרובות אחד עם השני. כדי למנוע זיהום צולבות של רקמות אלו על ההסרה, מבתר צריך בזהירות להקניט את המבנים האלה בנפרד. בנוסף, על החשיפה הראשונית של משי לייצור בלוטות, הבלוטות aciniform ו pyriform יהיה הקשה ביותר מיד לדמיין בשל גודל קטן שלהם ואת המיקום האנטומי. לעתים קרובות יש נוכחות של ביצים רבות. יתר על כן, טיפול נוסף צריך להילקח בעת הסרת בלוטת pyriform, כמו רקמת זה דביק מאוד בדרך כלל לדבוק מלקחיים שלך. כאשר תהליך זה נעשה כראוי, ניתן להשיג את כל שבעת משי לייצור בלוטות מן עכביש בודד באופן מטוהרים. בדרך כלל, אפשר לשחזר את הכמויות מיקרוגרם של רנ"א הכולל חלבון מן לנתיחה עכביש בודד. דוגמה באמצעות RNA סך qPCR לבחון את רמות ה-mRNA של גן מוגבלת fibroin tubuliform, TuSp1, מוצג (איור 4). ניסויים נציג שכוללות חלבון lysates שנאספו הבלוטות למשל, פתרון העיכול tryptic ואחריו MS ניתוח (יכול לשמש גם לניתוח MS / MS) או ניתוח הרכב חומצות אמינו מוצג (איור 5-6, בהתאמה).

באיור 1. טיפול, הרדמה, והסרה של שלד חיצוני מהבטן של עכביש אלמנה שחורה נקבה. א) העברת העכביש לתוך קופסת קרטון מצופה פלסטיק כדי להקל על העברת עכביש לתוך בקבוקון פלסטיק קטן. ב) Spider להציב לתוך בקבוקון פלסטיק עם תקע. ג) הרדמה העכביש עם גז דו תחמוצת הפחמן. ד) הפרדת cephalothorax מן הבטן באמצעות microscissors. E) Immobilization של הבטן במגש לנתח באמצעות סיכות חרקים. F) צפו לאחר חתך לרוחב הוא עשה עם מספריים חלק שלד הוא התגלגל חזרה עם מלקחיים. G) חתכים נעשים בניצב לחתוך לרוחב הראשונית. ג) הסרת שלד חיצוני וחשיפה של שכבת שומן.

איור 2. ויזואליזציה של שבע משי לייצור בלוטות שונות תוך פגע בבטנו של העכביש כמו גם הרקמות הסובבות. א) תמונות של tubuliform, ampullate הגדולות, flagelliform, במצטבר, רקמות ampullate קטין בהגדלה של 12X. ב) תמונה של בלוטות aciniform ו pyriform בהגדלה של 12X.

איור 3. תצלומים של שבעת משי לייצור בלוטות לאחר הוצאתם מן הבטן. כל התמונות שנתפסו בהגדלה 20X למעט aciniform ו pyriform בלוטות, אשר נעשו ב 40X. א) גדולampullate בלוטת; B) ampullate ראשיות ומשניות (צד ימין) לשם השוואה גודל: C) tubuliform: D) flagelliform; E) במצטבר; F) aciniform: G) pyriform.

איור 4. הנציג תוצאות דפוס הביטוי של הגן משי, TuSp1, לאחר מדידות TuSp1 רמות ה-mRNA של משי לייצור בלוטות שונות (למעט בלוטת pyriform) באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) בידוד הבאים של רנ"א הכולל בלוטות.

איור 5. דוגמה של ניתוח MS של תמציות חלבון המתקבל בלוטת pyriform הבאים עיכול, פתרון tryptic. הערה: x2 מייצג 2 פי הגדלה של עוצמת הספקטרום. ספקטרום מסות פפטיד יון שמתאימים אזורי fibroin PySp1 מוצגים עם סמל #.

איור 6. תוצאה אופיינית של פרופיל הרכב חומצות האמינו של חלבונים המופקים בלוטת tubuliform. הערה: ASX = ASP ו ASN; GLX = Glu ו Gln. צבע כחול משקף חומצות אמינו עם קבוצות שרשרת קוטבי צד ואילו צבע אדום מייצג את שאריות חומצת אמינו עם אי - קוטבי קבוצות שרשרת בצד.

Discussion

המתודולוגיה שלנו microdissection של משי לייצור בלוטות מן עכביש האלמנה השחורה מציעה אמצעי יעיל להשגת מטוהרים לייצור משי בלוטות. והניתוחים ניתן להשלים 1.5-3 שעות, מניב סט שלם של שבע נפרדות לייצור משי בלוטות מ cobweavers. קבלת מטוהרים משי בלוטת דגימות מאפשרת לחוקרים את היכולת לבצע מג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm