Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

Summary

Decellularization זלוף היא שיטה חדשנית לייצור פיגומים כבד כל כך שומרת על הרכב תאי מטריקס של איברים ארכיטקטורה. בזאת, השיטה של ​​הכנת פיגומים איבר שלם באמצעות decellularization זלוף ואכלוס הבאים עם hepatocytes מתואר. שתלי כבד פונקציונליים להשתלה ניתן להפיק באמצעות טכניקה זו.

Abstract

הכבד הוא איבר מורכב המחייב זלוף קבוע עבור אספקת חומרי מזון וחמצן וסילוק של פסולת על מנת לשרוד ^1. המאמצים לשחזר או לחקות את הכבד עם מיקרו בטענה את הגישה באמצעות הנדסת רקמות וטכניקות microfabrication לא הצליחו עד כה בשל האתגר הזה העיצוב. בנוסף, biomaterials סינתטיים המשמשים ליצור פיגומים רקמת הכבד יישומים הנדסיים היה מוגבל בזירוז התחדשות רקמות ולתקן במידה רבה בשל היעדר מוטיבים תאים ספציפיים מחייב כי תגרום הפונקציות תא תקין ^2. רקמות Decellularized יליד כלי דם כגון ³ ו - ⁴ עור מצד שני מצאו יישומים רבים בתחום הנדסת רקמות, סיפקו פתרון מעשי לחלק האתגרים. היתרון של מטריקס decellularized יליד הוא שהיא שומרת, במידה מסוימת, את ההרכב המקורי, מיקרו, ומכאן שיפור מצורף התא מחדש ^5.

בעבודה זו אנו מתארים שיטות לבצע זלוף-decellularization של הכבד, כך כבד bioscaffold שלם אשר שומרים על המבנה של כלי הדם הגדולים מתקבל. יתר על כן, אנו מתארים שיטות recellularize אלה bioscaffolds עם hepatocytes העיקרי מבוגר, יצירת שתל הכבד כי הוא פונקציונלי במבחנה, ויש לו גישה לכלי הכרחי עבור השתלת in vivo.

Protocol

1. כבד Decellularization

1. קציר כבד חולדה עם cannulation וריד הפורטל באמצעות ו - 18-מד קטטר. השאירו את נחות מעולה הווריד הנבוב פתוח. שמור את האיבר hydrated ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בצלחת פטרי 10 ס"מ.
2. הגדרת מערכת זלוף שמורכבת המאגר 8 ליטר, משאבת peristaltic ואת מלכודת בועה.
3. מלאו את המערכת זלוף עם פוספט שנאגרו מליחים להשאיר אותו פועל במשך 10 דקות. מלאו PBS לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולהפחית את קצב הזרימה של פוספט שנאגרו מלוחים 1 מ"ל / דקה.
4. בזהירות להעביר את הכבד כדי לקצור פוספט שנאגרו מלוחים מלאים 10 ס"מ צלחת פטרי.
5. המשך זלוף PBS לילה.
6. התחל זלוף עם 0.01% (w / v) dodecyl נתרן גופרתי (SDS) בתוך מים מזוקקים במשך 5 דקות.
7. Perfuse עם PBS שעה 1.
8. חזור על שלבים 1.6 ו - 1.7 שלוש פעמים נוספות להגדיל את זמן זלוף SDS עד 10 דקות, 15 ו 20 באותו זמן כל אחד.
9. המשך זלוף עם 0.01% (w / v) SDS למשך 24 שעות.
10. המשך זלוף עם 0.1% (w / v) SDS למשך 24 שעות.
11. Perfuse עם 0.2% (w / v) SDS במשך 3 שעות.
12. Perfuse עם 0.5% (w / v) SDS במשך 3 שעות.
13. Perfuse עם מים מזוקקים במשך 15 דקות.
14. Perfuse עם 1% (w / v) טריטון X-100 במים מזוקקים למשך 30 דקות כדי להסיר כל חומצות גרעין מחויב.
15. כדי לשטוף את המטריצה ​​הכבד decellularized (DLM), perfuse עם PBS למשך 2 שעות.
16. אופציונלי: לכרות את כל האונות מלבד האונה חציון.
17. חנות DLM בצלחת פטרי נקי ואטום ספוגה PBS ב 4 ^{מעלות צלסיוס} עד מוכן לשימוש (איור 1).
18. כדי לעקר את DLM: 1) הורידו את DLM עם סטרילי PBS המכיל 0.1% (V / V) חומצה peracetic ו -4% (v / v) אתנול דגירה במשך 3 שעות ב 4 ^o C. 2) לשטוף עם סטרילי PBS 2 פעמים. 3) שטפי עם סטרילי PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין, 10ug / mL גנטמיצין, ו -2.5 UG / mL amphotericin B. חנות הכבד decellularized בתמיסה באותו 4 ^{מעלות צלסיוס} עד מוכן לשימוש עבור ניסויים recellularization.

2. Recellularization של Decellularized כבד מטריקס

1. הגדרת מערכת זלוף שמורכבת חדר זלוף, משאבת peristaltic ואת מלכודת בועה בתנאים סטריליים. מלאו את המערכת זלוף עם 200 מ"ל של מדיום תרבות, למשל, גלוקוז DMEM גבוהה (Sigma), 10% בסרום שור העובר (Hyclone,), 100 מ"ל U ^-1 פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למ"ל ^-1 סטרפטומיצין (Invitrogen).
2. מניחים את המטריצה ​​הכבד decellularized בחדר זלוף ולחבר את DLM למערכת זלוף דרך צינורית את הווריד הפורטל בעוד המשאבה פועלת ב 5 מ"ל / דקה, כדי למנוע היווצרות של כל בועות האוויר.
3. אפשר זלוף של המדיום דרך DLM במשך 30 דקות.
4. בודד hepatocytes העיקרי של חולדה בוגרת עם הכדאיות לפחות 90%.
5. עצור את זרימת במערכת זלוף לאט להזריק 50,000,000 hepatocytes (ב 1-3 מ"ל של מדיום תרבות) לתוך המערכת זלוף דרך ללכוד את הבועה.
6. התחל את הזרימה ב 10 mL / min ו recirculate בינוני למשך 10 דקות.
7. חזור על שלבים 2.5 ו - 2.6 עד סכום של 200 מיליון תאים מוכנסים DLM (איור 2) ^6.
8. ברגע שכל התאים הם perfused לתוך DLM, לאסוף את perfusate לארבע 50 מ"ל ו - צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה בסל"ד 600 במשך 10 דקות. בטל supernatants לאסוף את כדורי לתוך צינור אחד. קבע את מספר התאים ואת הכדאיות באמצעות הרחקה trypan כחול כדי לקבוע את היעילות זריעה.

3. בתרבות חוץ גופית של שתל הכבד Recellularized

1. הגדרת מערכת זלוף שמורכבת חדר זלוף, משאבת oxygenator peristaltic, ואת מלכודת בועה בתנאים סטריליים (איור 3). מלאו את המערכת זלוף עם 50 מ"ל של מדיום תרבות, למשל, וויליאמס E '(Sigma), 5% בסרום שור העובר (Hyclone,), 0.5 מ"ל U אינסולין ^-1 (Eli Lilly), 20 ננוגרם למ"ל ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ננוגרם למ"ל גלוקגון ^-1 (בדפורד Laboratories), 7.5 מיקרוגרם למ"ל ^-1 הידרוקורטיזון (Pharmacia), 100 מ"ל U ^-1 פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למ"ל ^-1 סטרפטומיצין (Invitrogen).
2. מניחים את שתל הכבד recellularized בחדר זלוף ולחבר את DLM למערכת זלוף דרך צינורית את הווריד הפורטל בעוד המשאבה פועלת ב 5 מ"ל / דקה, כדי למנוע היווצרות של כל בועות האוויר.
3. בסביבה נקייה מחיידקים, לסגור את תא זלוף ולאטום היטב, כדי למנוע כל דליפה במהלך התרבות.
4. העברת מערכת זלוף אל באינקובטור כי הוא 37 ^{מעלות צלסיוס} ויש לו 10% CO ₂ ולהגדיל את קצב הזרימה זלוף עד 15 mL / min.
5. חבר את oxygenator ל 95% O ₂ ו - 5% CO ₂ מיכל גז תערובת ולהגדיר את קצב זרימת הגז עד 0.5 ליטר / דקה. זה צריך להגיע ללחץ חמצן חלקי של approximately 400 מ"מ כספית.
6. תרבות עשוי להמשיך עד 10 ימים עם השינויים היומיים של המדיום לתרבות. בינוני התרבות ניתן שנדגמו יומי לניטור של פונקציות הכבד של השתל כמו אוריאה, אלבומין והפרשת סך חומצות מרה. בסוף התקופה, תרבות, שתל הכבד recellularized ניתן שנדגמו לצורך ניתוח מולקולרית היסטולוגית.

4. נציג תוצאות:

Decellularization מלאה של הכבד עכברוש לוקח בערך 72 שעות באמצעות פרוטוקול המתואר. מטריקס שומרת על 100% כתוצאה של סיבי הקולגן, 50% glycosaminoglycans, ורק 5% של ה-DNA של הכבד יליד (טבלה 1) ^6. מבנה כלי הדם של מטריצה ​​נשמרת כפי שמעידים קורוזיה הליהוק ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 4) ^6. הנוכחות של ארכיטקטורה בתוך כלי הדם מאפשר DLM ואכלוס שלה עם תאים עם יעילות של 96% ו זלוף הבאים שלה עבור בתרבות חוץ גופית. שתל הכבד recellularized יכול להיות מתורבת עד 10 ימים במבחנה ומציג פונקציות הכבד תקין כפי שאושרו באמצעות אוריאה, אלבומין ו מרה סך הפרשת חומצה (איור 5) ^6.

באיור 1. Decellularized מטריצה ​​כבד בסוף התהליך decellularization. (א) את הכבד שלם (ב) האונה חציון לאחר כריתה.

איור 2. ייצוג סכמטי של recellularization של DLM.

איור 3. זלוף מערכת ההתקנה בתרבות במבחנה של שתל הכבד recellularized.

איור 4. מבנה כלי הדם נשמר במטריצה ​​הכבד decellularized. יצוק תמונות קורוזיה של א) התקינה של הכבד, ב) כבד decellularized vasculature, (כחול) פורטל (אדום) ורידים. סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של ג DLM) כלי שיט, ד) קטע ובו צינור המרה כמו כלי קטן (חיצים), ברים סולם (a, b) 5 מ"מ (ג, ד) 20 מיקרומטר.

איור 5. פונקציות הכבד ספציפיים של שתל הכבד recellularized במהלך בתרבות זלוף חוץ גופית. הפרשה) אלבומין (p = 0.5249), ב) ייצור אוריאה (p = 0.5271) ו - ג) מרה סך הפרשת חומצה (p = 0.0114). ניתוח סטטיסטי של ההבדל בין הניסוי ואת השליטה נעשה במשך 10 ד התרבות על ידי בדיקה של פרידמן בבית = 0.01. ברים שגיאה מייצגים SEM (n = 3).

	טרי livera	Decellularized הכבד מטריצה	P-ערכים	% הכבד טרי
	n = 4	n = 8
קולגן	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	114%
(מ"ג הכבד גרם)
Glycosaminoglycans	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0.004	47%
(מ"ג הכבד גרם)
ה-DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10 -5	2.9%
(מ"ג הכבד גרם)

טבלה 1. הרכב ביוכימי של מטריקס הכבד decellularized לעומת הכבד הילידים.
ערכים מיוצגים ממוצע ± SEM

Discussion

Decellularization זלוף השיטה המתוארת כאן מייצר הכבד פיגום שלם בעל מבנה ברוטו אותו ואת ארכיטקטורה כלי הדם של הכבד הילידים. הפיגום בעל הרכב תאי מטריקס דומה הכבד הילידים. השיטה משיגה recellularization Repopulation של הפיגום עם תאים בכל יעילות גבוהה התאים נשארים קיימא תפקודית במהלך התקופה

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149