חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

Summary

כאן אנו מתארים כיצד לייצר, להתרחב, immunolabel תאים בהיפוקמפוס לאחר הלידה אבי עצביים (NPCs) בתרבות (3D) תלת ממדי. בשלב הבא, תוך שימוש בטכנולוגיות הדמיה היברידית, אנו מדגימים כיצד תמונות דיגיטליות של cryosections immunolabelled יכול לשמש כדי לשחזר ולמפות את המיקום המרחבי של תאים immunopositive ברחבי neurosphere 3D כולו.

Abstract

חשיבותה של טופוגרפיה (3D) 3 מימדי להשפיע גזע עצביים תא אב (NPC) הוא נרחב פנוטיפ הודה עדיין מאתגר ללמוד. כאשר ניתק מן המוח העוברי או שלאחר הלידה, NPCs יחיד יתרבו ההשעיה כדי ליצור neurospheres. לתאי הבת בתוך תרבויות אלה באופן ספונטני לאמץ שושלות התפתחותיים שונים (נוירונים, oligodendrocytes, האסטרוציטים ו) במהלך התרחבות למרות היותו חשוף הסביבה תאיים אותו. זה משחזר את התקדמות בשלבים רבים של שנצפה במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במוח שלאחר הלידה והוא משמש לעתים קרובות ללמוד ביולוגיה NPC בתוך בסיסי בסביבה מבוקרת. הערכת ההשפעה המלאה של הטופוגרפיה 3D ומיצוב הסלולר בתוך תרבויות אלה על גורל NPC עם זאת, קשה. כדי למקם חלבונים היעד ולזהות שושלות NPC ידי immunocytochemistry, ריחוף ללא neurospheres חייב להיות מצופה על מצע או מחולק סדרתי. עיבוד זה נדרש כדי להבטיח permeabilization תא המקבילה וגישה נוגדן בכל תחום. כתוצאה מכך, תמונות של cryosections epifluorescent 2D או 3D שחזורים confocal של Z-ערימות יכול רק לספק מידע מרחבי על המיקום בתוך תא נפרד פרוסות 3D פיזי או דיגיטלי ולא לדמיין עמדה בתחום הסלולר ללא פגע. כאן, לחזור על הטופוגרפיה של התרבות neurosphere היתר ניתוח מרחבי של ביטוי חלבון לאורך התרבות כולה, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, הרחבה, חתך הסידורי של שלאחר הלידה neurospheres בהיפוקמפוס מתאים immunodetection epifluorescent או confocal של חלבונים היעד. Connexin29 (Cx29) הוא ניתח כדוגמה. בשלב הבא, באמצעות שילוב של עריכה גרפית ו מודלים 3D תוכנות ליישם בקפדנות כדי לשמור על פרט ביולוגיים, אנו מתארים כיצד להרכיב מחדש את המיקום המבני 3D של דימויים אלה מפה דיגיטלית תאים שכותרתו בתוך neurosphere המלא. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה וניתוח של העמדה של חלבונים היעד תאים ברחבי הטופוגרפיה התרבות כולה 3D ותאפשר ניתוח מפורט יותר של יחסים מרחביים בין תאים במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במבחנה.

שני Imbeault ו Valenzuela תרמו באותה מידה יש ​​לשקול המחברים first משותף.

Protocol

1. בידוד של ובתאים עצבית

שמור רקמות פתרונות קר בכל עת במהלך פרוטוקול בידוד!

1. לפני תחילת תרבויות שלך, להכין את פתרונות המניות הבאות:
   • דיסוציאציה מדיה (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 0.1 מ"מ CaCl ₂ * 2H ₂ O, 3.2 mM MgCl ₂ * ₂ O 6 שעות, 10 mM D-גלוקוז, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל . סטרפטומיצין סינון סטרילי לאחסן aliquots 10-15 מ"ל ב -20 ° C. הכן ריכוזי המניות של אנזימים המשמשים הסלולר דיסוציאציה כפולה מזוקקים H ₂ O, מסנן סטרילי aliquots חנות ב -20 ° C: פרוטאז עצבית (25 מ"ג . / mL), papain (10 מ"ג / מ"ל), DNAseI (10 מ"ג / מ"ל) ביום של הניסוי, אנזימים כדי להוסיף 15 מ"ל של דיסוציאציה מדיה על ריכוזי האחרון הבאות: 1 מ"ג / מ"ל ​​פרוטאז, 0.1mg / papain מ"ל, 0.1 מ"ג / מ"ל ​​DNAse פתרון I. Dissection המכיל ריכוזי האנזים הסופי יכול להיות כל הזמן על הקרח בתהליך לנתיחה.
   • תחזוקה מדיה: מדיום שונה Dulbecco של הנשר F12 (DMEM/F12), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 1X תוסף B27. יכול להישמר לתקופה של עד 3 חודשים 4 ° C, ללא תוסף B27 עד חודש אחד ב 4 ° C עם תוסף B27.
   • גורמי גדילה: הכן aliquots מלאי של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​גורם אנושי רקומביננטי הצמיחה אפידרמיס (hEGF) ו - 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​גורם גדילה פיברובלסטים-2 (FGF-2) ב DMEM/F12 + 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). חנות ב -20 ° C.
2. כדי להרדים קטלנית C57BL / 6 גורים עכבר, עכברים מוזרקים intraperitoneally עם Euthansol ביום הלידה 0-3.
3. מוציאים בזהירות המוח על ידי לנתיחה סטנדרטיים בחנות בצלחת 60 מ"מ המכיל מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, KCl 5 mM, CaCl 2 מ"מ ₂ * 2H ₂ O, 1.3 mM MgCl ₂ * ₂ O 6 שעות , 10 mM D-גלוקוז, 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין). עד 7.3 pH אם מסנן הדרושים סטרילי לתוך aliquots 50 מ"ל, חנות ב -20 ° C.
4. באמצעות סכין גילוח, המוח לחסום ידי הסרת המוח הקטן והמוח דבק עם בדבק מגע דבק, לצד מקורי למעלה, בצד הגבי פונה אליך, אל צ'אק vibratome. Leica Microsystems VT1000S vibratome משמש פרוטוקול זה.
5. מיקום צ'אק ב vibratome ומוסיפים ACSF וקרח לתוך התאים תקין.
6. חותכים פרוסות של 500 מיקרומטר עובי באמצעות מהירות בין 3.5-4.5 ותדירות 8.5.
7. איסוף פרוסות המכיל את היווצרות בהיפוקמפוס במאכלים המכילים ACSF.
8. שימוש stereomicroscope, להסיר hippocampi בין מ"מ -1.60 גבחת ו -2.40 מ"מ (עד אזור CA3 מתחיל עקומת ventrally) ומניחים צלחת יבשה חדשים (ללא ACSF). מיקרוסקופ MZ6 לייקה לנתח משמש פרוטוקול זה.
9. לאחר כל hippocampi נאספים, בשר טחון עם רקמה אזמל (עד מראה הומוגני נוזלי מושגת).
10. העברת רקמות טחון על צינור פוליפרופילן 15 מ"ל מכיל 2.5 מ"ל התקשורת דיסוציאציה המכיל פרוטאז עצביים, papain ו DNAse אני (ראה שלב # 1 להכנת פתרון). הערה אם יש הרבה רקמות מקור (למשל, מתוך 6 גורים) זה רעיון טוב להשתמש 2 בקבוקונים של 2.5 מ"ל ניתוק התקשורת כדי לשמור על האנזים אופטימלי: יחס רקמות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45-60 דקות עם רוטציה. ProBlot Labnet 6 תנור הכלאה (שנרכשו דרך מנדל מדעי) משמש פרוטוקול זה מוגדר הגדרת סיבוב 4.
11. הוסף 10 מ"ל של התרבות סטרילי פוספט אשלגן רקמות שנאגרו מלוחים (Kpbs: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 פוספט חוצץ מ"מ, pH 7.4) ו צנטריפוגות ב XG 300 דקות 5. צנטריפוגה Eppendorf (דגם 5702) משמש פרוטוקול זה.
12. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של Kpbs.
13. לנתק את הרקמה על ידי טחינה דקה באמצעות פיפטה פסטר.
14. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300 דקות 5.
15. תאים Resuspend ב 3 מ"ל של מדיום תחזוקה, ספירת התאים באמצעות Trypan כחול התאים בצלחת ב 60 לא חסיד מנות מ"מ (קורנינג Ultra-Low מנות דבקות מחייב משמשים פרוטוקול זה, ראה חומרים) בצפיפות של 2.5 x 10 ⁵ תאים / מנה ב 5 מ"ל של מדיום תחזוקה. צלחות פטרי יכול לשמש במקום Ultra-Low מנות דבקות אבל תרבויות ידרוש להיות טפח בבוקר ואחר הצהריים בכל יום במהלך התרחבות של 6 הימים הראשונים במבחנה (DIV) כדי למנוע ציפוי והבחנה ספונטנית.
16. הוסף hEGF לריכוז סופי של 20 ng / mL ו FGF-2 לריכוז סופי של 10 ng / mL מיד לאחר ציפוי. הוסף גורמי גדילה נוספת כל יומיים במהלך שלב הרחבה עד היום על איסוף DIV 14. (מוטות סולם וידאו של neurospheres הרחבת מייצגים 100 מיקרומטר).

** הערה: המדיה עשויה להפוך צהוב סביב DIV 10 של שלב ההתפשטות. במקרה זה, להוסיף עוד 1 מ"ל מאיntenance התקשורת. אם התקשורת היא צהובה שוב למחרת, להוסיף עוד 1 מ"ל של התקשורת תחזוקה - להמשיך לעשות את זה לפי הצורך במהלך שלב הרחבה שלך - לזכור להתאים את עוצמת הקול של גורמי גדילה בהתאם כדי לשמור על ריכוזים הסופי הנכון.

2. סידורי Cryosectioning

1. הקש neurospheres לפני בעדינות על מנת להבטיח קיבוע התחומים הם מופרדים היטב בזמן של קיבעון.
2. הוסף פורמלדהיד כיתה מולקולרית ישירות התרבויות לריכוז סופי של 3.7% ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות עם רעד איטי. רקדנית בטן Stovall משמש פרוטוקול זה מוגדר מהירות סיבוב של 2.5.
3. איסוף neurospheres בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל ו - ספין למטה XG 300 דקות 5.
4. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב פוספט 10 מ"ל נתרן שנאגרו מלוחים (nPBS: 154 mM NaCl, 10 פוספט חיץ mM). הערה שינוי השימוש בפתרון של Kpbs כדי nPBS.
5. ספין למטה XG 300 דקות 5.
6. Resuspend ב 50-10 מ"ל סוכרוז 20% (w / v) פתרון nPBS.
7. שמור neurospheres על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 24 כדי cryoprotect תרבויות.
8. מילוי cryomold חד פעמיות עם טמפרטורה אופטימלית מתחם (אוקטובר) חיתוך.
9. בעדינות יוצקים את הפתרון סוכרוז המכיל neurospheres לתוך צלחת.
10. השתמש stereomicroscope לאתר תחומי נציג בגדלים שונים עם הראיות לפחות של הפרעה מכנית. בעת ביצוע הליך זה בפעם הראשונה, בתרבויות מסוימות עשוי להיות שבור או קרוע. מורפולוגיה יישמר יפה עם תרגול.
11. בעדינות לשאוב כל neurosphere לתוך 1 מ"ל פיפטה קצה (לשמור את עוצמת הקול של סוכרוז המכיל-פתרון להסיר למינימום) ולמקם אותו למתחם אוקטובר סמן המיקום המשוער שלך על התבנית, כך שתוכל למצוא את התחומים מאוחר יותר.
12. ברגע שיש לך הניח כמה כדורים לתוך cryomold, פלאש להקפיא את הדגימות באמצעות CO ₂ עד אוקטובר הוא לבן.
13. סמן את מיקומו של תחומים על קוביית ופופ הקוביה מתוך התבנית
14. באמצעות טרום צונן מלקחיים, במקום את הקוביה על פיסת נייר סינון מאובטח בעבר צ'אק עם אוקטובר
15. מקום נוסף במתחם אוקטובר סביב קוביית ולהקפיא לדבוק בלוק המכיל את התחומים באמצעות ה-CO _2. לחילופין מקום צ'אק (עם נייר סינון) ב cryostat, להשפריץ מתחם אוקטובר על נייר סינון קוביית המקום ישירות אוקטובר המתן עד אוקטובר הוא לבן וקשה. CM1900 לייקה cryostat משמש פרוטוקול זה.
16. לאחר מתחם אוקטובר הופך לבן, אתה יכול למקם את צ'אק על לחסום את החיתוך, ולאחר מכן להמתין לפחות 30 דקות על הטמפרטורה לאזן.
17. גזור סדרתי סעיפים 10 מיקרומטר מחפש את הסימנים שלך לבדוק לעתים קרובות תחת מיקרוסקופ עבור חלקים neurosphere. מקום כמו חלקים רבים ככל שתוכל לשקופית אחת. הערה ייתכן שלא תוכל לראות את הפרוסות הראשונות של neurosphere שלך ​​תחת היקף, כך לאסוף את כל החלקים עד שתראה תאים לשמור על 3-5 סעיפים לפני תחילת הזה בסוף התחום שלך. סעיפים אלה הקדמי ואת האחורי יהיה גם מעובדים immunocytochemistry. Counterstain גרעיני בעת ביצוע immunostaining הוא המפתח ולכן כפי שהוא יאפשר לך לזהות תאים בודדים בקטבים neurosphere לא ברורה ממבט ראשון תחת מיקרוסקופ רגיל שלב הפוכה.
18. חנות חלקים ב -20 ° C.

3. Immunocytochemistry

1. הסר שקופיות -20 ° C ו להפשיר על ידי יישום nPBS בעדינות על כל חלקי ו דוגרים על RT במשך 5 דקות.
2. פליק את nPBS עודף ומיד להחיל נוגדן ראשוני מדולל Ab חיץ (0.3% Triton X-100, בסרום שור 0.3% אלבומין nPBS, pH 7.2). יהיה עליך ~ 100 μL לכל שקופית. בפרוטוקול זה, אנו בתרגום Cx29 ב הצאצאים NPC בדידה נוכח תרבות neurosphere 3D.
3. מכסים parafilm לחתוך כדי לכסות את החלקים אך לא יעלה על גודל של השקופית מיקרוסקופ כמו נוגדן יצויר את השקופית על ידי אוסמוזה parafilm אם מגיע או עולה על רוחב של השקופית. Parafilm ימנע אידוי. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לח. תשמרי לצוף parafilm על הסעיפים ואינם מאפשרים זאת לדבוק השקופית. עם זאת, אין להסיר או לשנות את המיקום parafilm להחיל פעם יש להקפיד לא ליישם את כל כוח גזירה על הסעיפים, ובכך לשבש את המורפולוגיה.
4. הוסף את ~ 1 nPBS מ"ל ישירות מדורים לצוף מעל parafilm. לחלופין, במקום להחליק במאונך ישירות בתוך צנצנת coplin עד parafilm צף משם. אין להסיר את parafilm עד שהוא צף משם עצמאי של מניפולציה כפי שאתה יכול לשבש את מבנה neurosphere שביר. לאחר parafilm כבויה השקופית, דגירה 5 דקות ב RT. פליק את nPBS ולהמשיך עם 3 שוטף יותר RT במשך 5 דקות.
5. החל נוגדנים משני מדולל Ab חיץ לדגור על RT עבור 1שעות בתא לח כמתואר לעיל. אתה שוב דורשים ~ 100 μL / שקופית.
6. חזור שוטף nPBS בשלב 4. החלת counterstain גרעיני 3 ^rd לשטוף (Hoechst 33,258 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ב nPBS) במשך 5 דקות ולהמשיך עם לשטוף הסופי עבור 5 דקות ב RT.
7. הר אנטי לדעוך המדיה המועדפת גובר coverslip, הבטחת coverslip עם הראשון nailpolish בפינות אז כל בקצוות כדי למנוע הפסד (אם באמצעות מבוססי גליצרול התקשורת).
8. המשך לאוסף התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים DMRA2 לייקה, מצלמה אורקה Hamamatsu ER ו OpenLab v3.56 תוכנה. בדוגמה זו, התמונות שנתפסו על שלושה ערוצים: (1) שלב, לעומת זאת, (3) כחול סגול (לייקה A4 קוביה: סינון שילובים אקס 360/40, 400 די, Sp BP470/40), ואת האדום (לייקה Y3 קוביה : שילובים סינון אקס BP535/50, די 565, Sp 610/75). תירה בכל סעיף סדרתי הקדשת תשומת לב הראשון בסעיפים האחרונים על ידי מעקב אחר הקטבים באמצעות Hoechst 33258 תיוג של ה-DNA שבו זיהוי שלב של תאים בודדים קשה.

4. מערך

1. כאשר cryosections הם להפשיר רכוב על גבי קווי מיקרוסקופ, הם יעברו ולסובב מעט מאוד. סטיות אלה יש לתקן. יתר על כן, כאשר כל מקטע הוא סדרתי הדמיה, מרכז של כל תמונה לא יכול להיות באותו מקום על המסך. כתוצאה מכך, כל מקטע סדרתי דיגיטציה יש realigned בקפידה בסעיף הקודם כדי לשמור על מורפולוגיה מדויק. מערך זה דורש תשומת לב קפדנית ומדויק cytoarchitecture ופרטים טופוגרפיים.
2. תמונות סידורי של כל ערוץ וברים בהיקף תושב 10 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר (הוקמה בשנת תוכנה v3.56 OpenLab) נשמרים קבצים בודדים TIFF ו המיובאים לתוך Photoshop CS4 באמצעות בד בגודל סטנדרטי של 3300 x 2550 פיקסלים ברזולוציה של 72 פיקסלים / אינץ'. תשומת לב לגודל הבד חייב להילקח ביבוא זה כדי לשמור על קנה מידה מדויק. גודל בד ברזולוציה הם המפתח דוגמנות הבאים MAYA. סרגל קנה המידה, הציל כשכבה נפרדת ב-Photoshop, יש להשתמש כדי לוודא כי אין לשנות את הממדים XY מתרחשת במהלך יישור Photoshop.
3. בשלב הבא, לקשר את שלושת (או יותר) שכבות המקביל לפרק אותו (כלומר, כל קישור שלב, UV, סדרת Cy3 תמונה עבור כל מקטע). זה מבטיח כי כאשר שכבה אחת מיושר, שכבות אחרות הקשורות סעיף מיושרים גם באותו זמן. לחלופין, ניתן לנעול את שכבת שלב פעם במצב המתאים (ראה להלן) ולאחר מכן ליישר את שכבות הקשורות סעיף זה על השכבה שלב.
4. כדי להתחיל, להפוך את כל השכבות נראית ידי לחיצה על סמל "עין" בחלון השכבות.
5. הפעל לעומת הראשון והשני שלב תמונות של בסעיפים סדרתי neurosphere על ידי לחיצה על סמלים "עין" בחלון השכבות. להגביר את השקיפות של החלק השני. תחת הלשונית "תמונה", פתח "סיבוב התמונה" ובחר "שרירותי". סובב את החלק השני עד שאתה מסוגל לזהות נקודות של רצף גיאומטריות מבנית בין תמונות. זה מועיל להשוות הלוך ושוב עם ערוץ UV (Hoechst 33,258 שכותרתו חלקים).
6. חזור על כל הסעיפים הבאים משווים סדרתי "השכנים הקרובים ביותר" (כלומר, את החלק הקדמי מיידי עם החלק האחורי מיידית) עד אשר כל החלקים וכל ערוצי מיושרים במדויק.
7. יצירת מטוס מאיה V10 זה של פרופורציות זהה לזה של הקובץ Photoshop.

5. תא טיפולוגיה

1. מהקו מצב של ממשק המשתמש של מאיה, לשנות את שורת התפריטים של הגדרת ברירת המחדל שלה אנימציה על משטחים.
2. השתמש כדור חלוקה פרימיטיבית כדי ליצור את גוף התא.
3. עם neurosphere הנבחר, להתחיל מניפולציה הקודקודים שלה על ידי לחיצה על כפתור העכבר הימני על האובייקט ובחירה ורטקס מתפריט סימון. יתר על כן לפרט את פני השטח של התחום על ידי שינוי רמת תצוגה מתפריט סימון.
4. בכרטיסייה תת מחלקה משטחים של התפריט הראשי, לפתוח את היררכית כווץ תיבת אפשרויות לקבוע את מספר רמות 2. כווץ את הכדור.
5. שנה את שורת התפריטים של משטחים מצולעים.
6. עם התחום הנבחר, פתח את כלי גיאומטריה לפסל מהכרטיסייה Mesh של התפריט הראשי.
7. מקד את פני השטח של התא לצורתו הסופית העסקת הכלים גיאומטריה לפסל מהכרטיסייה כלי הגדרות.
8. חזור על תהליך זה כדי ליצור גופים תאים שונים כדי לדמות את מגוון NPCs והצאצאים NPC נוכח neurosphere. בהפגנה זו, עשר גופות תאים שונים להוות בסיס neurosphere.
9. בחר את הטיפולוגיה תא הקפאה טרנספורמציות.
10. עם התאים של טיפולוגיה שלך הוקמה, שני shaders השטח יהיה שנועד לייצג את שני התאים לבטאהחלבון של עניין (בדוגמה שלנו Cx29 חיובי תאים) תאים שבהם החלבון נעדר. כאן, כל תא עם immunoreactivity Cx29 מיועד Cx29 חיובי. בדוגמה זו, לוקליזציה subcellular אינו הדגם למרות ניתוח כזה אפשרי עם שינויים shaders.
11. פתח את חלון Hypershade מתוך הכרטיסייה> טיוח Windows העורכים של התפריט הראשי.
12. בחר Shader הרמפה מהכרטיסייה Surface חומרים.
13. פתח את עורך תכונה ולהגדיר את צבע shaders, התלהטות, צבע אמביינט, מפת באמפ, ותכונות צבע Specular.
14. הקצאת מרקם 3D בראונית לצומת צבע אמביינט ו מרקם Fractal 2D לצומת מיפוי הקפץ.
15. בחר את הקלט shaders כתוצאה חיבורי פלט ולייצא את הרשת הנבחרת.
16. בחר את הטיפולוגיה התא לפתוח את תיבת אפשרויות לבחירה ייצוא.
17. בחר את סוג הקובץ mayaAscii ובטל את סימון התיבה כלול אלה תשומות. ייצוא בחירה.

6. מיפוי Cell

1. פתח קובץ קטעים מיושרים סדרתי ב Photoshop CS4.
2. הקמת מרכזי של משיכות עיפרון כדי לסמן את מיקומם של כל תא אב בסעיפים סדרתי. בהפגנה זו, המפתח של שלוש משיכות - ריבוע מלא, ריבוע עם קו מקווקו, וכן ריבוע עם צלב - ישמשו כדי לציין אם התא נמצא אחד, שניים, או שלושה חלקים. מפתח זה של שבץ נוסף מוגדר על ידי צבע - בדוגמה זו, אדום מייצג תאים לבטא חלבון שלנו של עניין, Cx29, לבן מייצג תאים לא מביע Cx29.
3. סובבו את השכבה על שלב ולהתחיל לציון מרכז של כל תא אב עם שבץ עיפרון לבן. השתמש בשכבה נפרדת בתוך התיקייה שבה סעיף לבנות מפות שלך.
4. מעבר בין סעיפים כדי לאתר את מיקום התאים להבטיח כי התאים על סעיף אחד או יותר מסומנים כראוי.
5. עם שכבת Cx29 מופעלת, בחר את התאים ליפול באזורים בהם Cx29 מתבטא בחיוב.
6. בחרו את הפקודה מלא מן בכרטיסיה עריכה של שורת התפריטים הראשי של Photoshop ולשנות את משיכות לבן לאדום.
7. עם המפות הושלמה, לשמור כל סעיף כתמונת jpeg נפרד בתיקייה sourceimages הפרויקט מאיה. כדי לעשות זאת, בפרויקט חדש מאיה יהיה הראשון צריך להיות שנוצר.

7. ייבוא ​​הרכבת מפות ב-3D

1. מהקו מצב של ממשק המשתמש של מאיה, לשנות את שורת התפריטים של הגדרת ברירת המחדל שלה אנימציה פוליגונים.
2. ייבוא ​​קבצים planes.mb ו scaleBar.mb מהתיקייה הקלעים פרויקטים.
3. עם המטוס הנבחר, להקצות-Shader למברט ידי לחיצה על כפתור העכבר הימני על האובייקט פתיחת לשונית הקצאת חומר חדש.
4. עורך את התכונה לחץ על תיבת משובץ בצד ימין של תכונה חומרי צבע.
5. מתוך התפריט הנפתח, בחר 'קובץ' ממדור 2D ומרקמים.
6. תחת סעיף קובץ תכונות עורך את התכונה, לחץ על סמל הקובץ בצד ימין של התכונה שם תמונה.
7. בחר את הקטע הראשון מהתיקייה sourceimages.
8. החלף את המצלמה של חלון סביבת עבודה מתצוגת מבט אל הנוף למעלה אורתוגרפיים ברירת המחדל על ידי פתיחת הכרטיסייה פאנלים.
9. בחר את הכלי מצולע צור מהכרטיסייה Mesh של התפריט הראשי להתחקות אחר קווי המתאר של הסעיף.
10. בחר את המפה הראשונה מהתיקייה sourceimages ולהקצות אותה למישור המצולע החדש שנוצר בעקבות הצעדים הוקמה כדי ליצור את המטוס מצולע.
11. עם האובייקט שנבחר, בחר UV מתפריט סימון על ידי לחיצה על כפתור העכבר הימני על המטוס.
12. בחר את כל המטוסים נקודות UV ו לפתוח את עורך UV מרקם בכרטיסייה Windows של התפריט הראשי.
13. סולם יחסי של UV כדי להתאים את המטוס סעיף.
14. חזור על תהליך זה עבור כל מקטע של neurosphere להבטיח כי רווחים בין כל קטע מתאימות בגובה של סרגל מידה.

8. איתור תאים ובתאים טיפולוגיה ב-3D

1. מהקו מצב של ממשק המשתמש של מאיה, לשנות את שורת התפריטים של ברירת המחדל שלו אנימציה הגדרה Dynamics.
2. ומשאיר רק את החלק הראשון של neurosphere הנראה, להסתיר את כל החלקים האחרים על ידי שינוי הגדרות התצוגה של בכרטיסיה תצוגה של התפריט הראשי.
3. עם אפשרויות הכלי Curve של קורות חיים קופסה פתוחה, בחר 1 בשכבות מן הגדרות Curve קורות חיים.
4. צופה את הסצינה מהמצלמה להציג למעלה, להתחיל הקצאת מצביע על מפות התא, היוצר אחד עקומת עבור Cx29 שלילי תאים ואחד עבור Cx29 חיובי תאים.
5. עקומות כתוצאה הן שטוחות כאשר צפו ממצלמה להציג צד. קבע את עובי של חלקים על ידי העברת נקודות של עקומת ציר ה-Y באמצעות סרגל מידה שיובאו התמונות מיקרוסקופיה כמדריך.
6. חזור על תהליך זה עבור כל מקטע של neurosphere.
7. ייבוא ​​קובץ מתיקייה cellTyoplogy.ma הקלעים של הפרויקט לשכפל את התא טיפולוגיה הן בתאים Cx29 שלילית Cx29 חיובי בתוך neurosphere.
8. פתח את חלון Hypershade מתוך הכרטיסייה> טיוח Windows העורכים של התפריט הראשי.
9. ייבוא ​​shaders שנבנו בעבר הקצאת אותם התאים של טיפולוגיה.
10. מחלון Outliner, להסיר את שם הקובץ מההתחלה של האובייקטים המיובאים. זה יהיה חשוב בשלבים מאוחרים יותר של תהליך דוגמנות.
11. בחר את הכרטיסייה חלקיקים מהתפריט הראשי וליצור החלקיקים emitter עבור עקומת קורות החיים הראשונה.
12. פתח את הכרטיסייה particleShape1 ותחת תכונות פליטת לשנות את הרוזן מקס מ -1 עד מספר הנקודות על עקומת הראשון שלך.
13. ב לדקלם את תכונות הכרטיסייה לשנות את סוג לדקלם החלקיקים אל פני השטח Blobby (S / W). לחץ על תיבת לדקלם נוכחי סוג למטה ולשנות את רדיוס של חלקיקים 0.010.
14. צרף את החלקיקים אל הקודקודים של העקומה הראשון על ידי בחירת חלקיקים אז משמרת בחירת עקומה. פתח את אפשרויות המטרה מתוך הכרטיסייה חלקיקים של התפריט הראשי להגדיר את משקל המטרה 1. לחץ על צור.
15. בחר את התאים ממספר 1 עד 10 כדי בחלון Outliner לפתוח את Instancer (החלפה) בתיבת האפשרויות מתוך הכרטיסייה חלקיקים של התפריט הראשי. בתיבה מופע אובייקטים, עשר כל התאים צריכים להיות רשומים בסדר.
16. בחר את השם הנכון particleShape מן הרשימה הנפתחת של אובייקט החלקיקים ללשונית למשל. לחץ על צור.
17. כברירת מחדל, רק את התא הראשון שנבחר יחליף את חלקיקי אורך העקום. על מנת לקבל את כל עשר סוגי להופיע מחזור באופן אקראי בין החלקיקים, ביטוי הוא זקוק. הביטוי השני יבטיח כי התאים פולטים אקראי באותו אופן בכל פעם את המחוון טווח מיקומו.
18. עם פולט הנבחרת, פתח את עורך תכונה. בכרטיסייה particleShape, תחת התכונה Dynamic הוסף לחץ על תיבת כללי. תחת שם ארוך לכתוב random_index. בשנת הבורר תכונה סוג של סקלר כדי החלקיקים Per (array) ופגע הוסף.
19. ב החלקיקים Per (Array) תכונות הכרטיסייה, תיבת random_index שנוסף לו. לחיצה על כפתור העכבר הימני על שטח ריק, בחר צור הביטוי ... מ הגלילה.
20. הקלד את הטקסט בביטוי: תיבת - particleShape1.random_index = rand (10), אם (particleShape1.particleId == 1) זרע (1);
21. כדי להשלים את הביטוי לפתוח את Instancer (החלפת גיאומטריה) הכרטיסייה עורך את התכונה ובאופן כללי אפשרויות> random_index אינדקס אובייקט לבחור מתוך הרשימה הנפתחת. תביאו את המחוון זמן המסגרת הראשונה ופגע לשחק, סוגי התא כיום מופצים באופן אקראי בין חלקיקים.
22. חזור על תהליך זה עבור כל מקטע של neurosphere. ודא כי כל מדד פולט instancer חדשה, אקראי הוא הבדיל בשמו מאורגן כראוי בחלון Outliner.

9. טיוח / Compositing

1. ב לדקלם את השימוש בסעיף של החלון Render Settings, לשנות את מפיק מן התוכנה מאיה נפשי ריי.
2. פתח את הכרטיסייה איכות תחת raytracing לשנות את ההגדרה הרהורים לאפס. פתח את הכרטיסייה framebuffer ולשנות את Colorclip מ Premultiply גלם אלפא בטל.
3. פתח את עורך Box / Layer ערוץ ולשנות את עורך שכבה ההגדרה של הצגת לדקלם.
4. בחר את התאים מיובאים של טיפולוגיה ולחץ על יצירת שכבה חדשה הסמל שנבחר להקצות אובייקטים.
5. שנה את שכבת חסימה הסביבה.
6. לחיצה על כפתור העכבר הימני על השכבה החדשה שנוצרה, בחר מאפיינים מהתפריט.
7. בצד ימין של תיבת renderLayer, לחץ על כפתור Presets ובחר ספיגה מתוך הרשימה הנפתחת.
8. בחר את הכרטיסייה mib_amb_occlusion1 ולשנות את דוגמאות 16-256.
9. פתח מחדש את תיבת עורך / Layer ערוץ תחת בכרטיסיה אפשרויות, לפתוח את תיבת שכבות לדקלם כל האפשרויות.
10. בחר Composite ולשמור שכבות.
11. עם שכבת ambientOcclusion נבחר, לשנות אותו רגיל עד הכפלת מן הנפתחת תיבת בדיוק מעל השכבה ברשימה.
12. לדקלם שני מעברים של neurosphere, פעם אחת עם שכבת ambientOcclusion מופעל פעם עם masterLayer דולק. שמור את התמונות כקובצי IFF בתיקיית תמונות פרויקטים.
13. פתח את שתי התמונות Photoshop CS4. מניחים את השכבה ambientOcclusion על גבי masterLayer ולהגדיר אותו הכפל. יצירת רקע לשטח את התמונה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך לתרבות סדרתי שלאחר הלידה cryosection NPCs בהיפוקמפוס, בתרגום ביטוי החלבון על ידי immunodetection, ולבסוף לשחזר ולנתח את המיקום הטופוגרפי של תאים immunopositive בתוך neurosphere 3D כולו. על ידי שילוב של ביולוגיה של התא תרבות וטכניקות עיבוד, הדמיה מיקרוסקופית (OpenLab, אימפרוביזציה ועוד תוכנות ניתוח התמונה), תוכנת עריכת גרפיקה יכולות (Adobe Photoshop), ו 3D אנימציה והתוכנה יכולות compositing (Autodesk Maya), אנו מציגים מתודולוגיה לשחזר את הרכב הסלולר כולו של תרבויות 3D מ 2 ד תמונות סידורי המאפשר שחזור נאמן של עמדת הסלולר ביטוי חלבון בכל תרבות neurosphere. פרוטוקול זה יכול להיות בשילוב עם יעילות שווה ההרשמה ושיקום epifluorescent סעיפים סדרתי דק או confocal Z-ערימות דרך קטעים סדרתי עבה. בגלל התרחבות המשובטים של NPCs אחת משחזר תרבות neurosphere רבים בשלבים נצפתה במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במוח שלאחר הלידה, את ההשפעה של מבנה 3D שלה מייצג NPC חשוב גורל הקובע צאצאים שנחשפו בסביבה ניסויית אותו ^1. סטייה בשושלת וביטוי חלבון הליבה והפריפריה סעיפים neurosphere סדרתי מציע כי גורמים פיזיים מרובים לרבות העמדה התא, לחץ מכני, וכוח גזירה תפקיד חשוב בוויסות NPC ביולוגיה ^2. יתר על כן, הביטוי connexin חלבון, ניתחו כאן, הוכח לשנות בהתאם NPCs כאשר הם מתורבתים כמו neurospheres 3D של השעיה או מצופה על מצע laminin עם תקשורת connexin בתיווך פונקציונלי שונה אם התאים בתרבית על מצע פלסטיק או 3D בחינם צף תרבויות ^3. ההשפעה של עמדת הסלולר על גורל NPC עדיין לא ברור. זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לנתח את ההשפעה של מיקום מרחבי בתוך התרבות 3D על הביולוגיה NPC בהתחשב בכך הערכה antigenic השושלת ו איתות חלבונים דורש שיבוש של ארכיטקטורת 3D כדי לאפשר permeabilization התא נוגדנים גישה לכל התאים. כאן, אנו מראים כי מתודולוגיה להדמיה היברידית מספק אמצעי לקבוע אם חלבונים מסוימים התערוכה לגרסאות המגוירות מיקומית ייחודי בתרבות 3D, ניתן להשתמש בהם כדי להסיק ולבדוק תפקוד החלבון ופיקוח ביחס לוקליזציה אזוריים בתוך neurosphere, וגם, ואולי הכי חשוב , מספק את הנתונים מיקומית נדרש ללמוד את ההשפעה של הטופוגרפיה 3D ומיצוב הסלולר על גורל NPC בתרבות 3D.

Materials