אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

Summary

אסטרטגיה גנטית מולקולרית למציאת דה נובו מוטציות גרימת הפרעות שכיחות כמו אוטיזם וסכיזופרניה.

Abstract

ישנם מספר קווים של ראיות התומכות את התפקיד של מוטציות דה נובו כמנגנון בהפרעות נפוצות, כגון אוטיזם וסכיזופרניה. ראשית, דה נובו שיעור המוטציות בבני אדם גבוה יחסית, כך נוצרות מוטציות חדשות בתדירות גבוהה באוכלוסייה. עם זאת, מוטציות דה נובו לא דווחו המחלות הנפוצות ביותר. מוטציות בגנים מובילים למחלות קשות בהם יש סלקציה שלילית חזקה נגד פנוטיפ, כגון הקטלניות בשלבים עובריים או כושר הרבייה מופחת, לא יועבר לבני משפחה רבים, ולכן לא יזוהו על ידי מיפוי גנטי הצמדה או התאגדות מחקרים. תצפית של הקונקורדנציה גבוה מאוד תאומים מונוזיגוטיים ו הקונקורדנציה נמוך מאוד תאומים dizygotic גם מאוד תומך בהשערה כי חלק ניכר מהמקרים עשויים לנבוע מוטציות חדשות. כזה הוא המקרה של מחלות כמו אוטיזם וסכיזופרניה. שנית, למרות כושר הרבייה מופחת ¹ וגורמים סביבתיים משתנה מאוד, השכיחות של מחלות מסוימות נשמר ברחבי העולם בשיעור גבוה יחסית קבוע. זהו המקרה של אוטיזם וסכיזופרניה, עם שכיחות של כ -1% ברחבי העולם. עומס מוטציוני יכול להיחשב איזון בין מבחר בעד או נגד מוטציה מזיקה הייצור שלה על ידי מוטציה דה נובו. שיעור נמוך יותר של רבייה מהווה גורם סלקציה שלילית שיש לצמצם את מספר אללים מוטנטים באוכלוסיה, ובסופו של דבר מובילים שכיחות המחלה פחתה. אלה לחצים בררניים נוטים להיות בעוצמה שונה בסביבות שונות. עם זאת, הפרעות נפשיות חמורות אלה נשמרו על שכיחות גבוהה יחסית קבוע באוכלוסיה ברחבי העולם במגוון רחב של תרבויות ומדינות למרות בחירה שלילית חזקה נגדם ^2. זה לא מה שניתן היה לחזות במחלות עם כושר הרבייה מופחת, אלא אם כן יש שיעור גבוה מוטציה חדשה. לבסוף, את ההשפעות של גיל אבהי: קיים סיכון מוגבר משמעותית של המחלה עם הגיל אבהי הגדלת, אשר יכול לנבוע להגדיל את גיל הקשורים מוטציות דה נובו אבהי. זהו המקרה של אוטיזם וסכיזופרניה ^3. יחס הזכר אל הנקבה של שיעור המוטציות מוערך בכ 4-6:1, ככל הנראה עקב מספר גבוה יותר של תא הנבט חטיבות עם הגיל אצל גברים. לכן, אפשר היה לחזות כי מוטציות דה נובו יבואו בתדירות גבוהה יותר מן הזכרים, במיוחד גברים מבוגרים ^4. שיעור גבוה של מוטציות חדשות עשוי בחלקו להסביר מדוע מחקרים גנטיים נכשלו עד כה לזיהוי גנים רבים predisposing אל מתחמי גנים למחלות, כמו אוטיזם וסכיזופרניה, ומדוע מחלות זוהו על 3% בלבד של גנים בגנום האנושי . זיהוי עבור דה נובו מוטציות כגורם למחלה מחייבת גישה מולקולרית ממוקד, הכולל הורים לימוד מקצועות המושפעים. תהליך לקביעת אם הבסיס הגנטי של המחלה עלולה לגרום לחלק מן המוטציות דה נובו ועל הגישה המולקולרית להקים קישור זה יהיה מאויר, באמצעות אוטיזם וסכיזופרניה כדוגמאות.

Protocol

1. בחירה של המחלה עלולה להיגרם על ידי מוטציות דה נובו

מחלה המתאים הקריטריונים הבאים יכול להתאים עם ההשערה נובו מוטציה דה:

1. כושר הרבייה מופחת.
2. שכיחות המחלה גבוהה יחסית קבוע למרות נרחב סביבות שונות.
3. המחלה קשורה בגיל אבהית גבוהה יותר.
4. הצמדה קלאסי האגודה ללימודי נכשל להסביר חלק ניכר תורשתיות במחלה.
5. הנתונים הקונקורדנציה התאום תמיכה מודל דה נובו.

ניתוח של סבירות כי מחלה נפוצה שבה מוטציות דה נובו עשוי בחלקו להסביר את הבסיס הגנטי הוא השלב הראשון קריטי.

2. מבחר מקרים דגימות DNA

מבחר דוגמאות המתאים הוא קריטי להצלחה של זיהוי המוטציות דה נובו. כדי למקסם את הסיכוי למצוא מוטציות דה נובו, אנו ממליצים על הבאות:

1. בחר המקרים עם הגיל המוקדמים של הופעת פנוטיפ, קשה, עם ההורים מושפעים, אבות מבוגרים ללא היסטוריה המשפחה המורחבת של המחלה.
2. בחר חולים אשר DNAs זמין מספיקים כדי לנהל את המחקר. קריטי במיוחד הוא הזמינות של ה-DNA ממקור תא ראשוני זה לא היה נתון culturing (DNA דם כגון DNA או רוק),
3. הזמינות של ה-DNA שני ההורים הוא קריטי על מנת לקבוע את השידור מוטציה מעמד (בירושה לעומת דה נובו). זמינות של קבוצות מושפע נוספים שולטת נורמלי הוא הכרחי עבור אימות מחקרים גנטיים פעם גנים מועמדים מזוהים.
4. הערכת גודל המדגם מבוסס על שיעור המוטציות, כמות הגנים שיוקרנו ואת אומדן של שבריר של מקרים שעלולים לנבוע מוטציה דה נובו.

3. ג'ין resequencing, שתי הגישות העיקריות

1. איכות גבוהה נמוך התפוקה רצף
   גישה זו מבוססת על גישות גנים מועמדים.
   1. בחירה של מועמד הגן (ים)
      בחר את הגנים המועמד הטוב ביותר על בסיס מערכת ניקוד אשר בנויה על 6 קריטריונים מרכזיים. ואז לחשב את סך תאמו את הסכום של כל הנקודות המיוחסות באמצעות ששת הקריטריונים המפורטים בטבלה 1. ראה למשל מהפרויקט שלנו דמות 1 של התפלגות גנים נבחרים ולא נבחרים.
      
      טבלה 1. קריטריונים המשמשים מבחר הגן המועמד
      
      
      באיור 1. גרף המציג את החלוקה של גנים נבחרים ולא נבחרים עבור סידור בפרויקט שלנו. קיבלנו חלוקה של גנים מדורגים לפי תכונות המועמד על ידי הגנים מיון לפי שווי הציון שלהם. לדוגמה, SHANK3 ו NRXN1 הגנים, שני הגנים שמצאנו מוטציה דה נובו, היו ציון 7 ו -6 בהתאמה (המקסימלי הוא 12).
   2. עיצוב primers Primers3 באמצעות תוכנה דרך Exonprimer. רק קידוד אזור צומת אחוי צריך להיות מכוסה כולל 50 זוגות תוספת לבסיס בכל צד של אקסון.
   3. מטב PCR התנאים הבחירה של תקי, עוצמת התגובה וכו '
   4. מטב את כל שברי PCR
   5. Amplify 5 ננוגרם של הדנ"א הגנומי המופקים דגימות דם על פי נהלים קבועים
   6. לפני שליחת על רצף, לבצע בקרת איכות של מוצרי ה-PCR שלך על ידי טעינת 2% agarose ג'ל. נבחרים באופן אקראי דגימות.
   7. רצף מוצרי ה-PCR על ה-DNA Analyzer על גדיל אחד. שבר נחשב רצף בהצלחה אם ניתוח של מעל 90% של עקבות אפשרי. זה ישים להקרנה בקנה מידה גדול.
   8. גרסאות איתור
      1. השתמש בכלים לזיהוי genotyping הגנומי של וריאציות כגון PolyPhred, Polyscan ו המודד מוטציה. שילוב של יותר מ 2 כלי איתור אידיאלי. לדוגמה, PolyPhred v.5 ו PolyPhred v.6 עם הגדרות ברירת המחדל אינם מזהים את הווריאציות אותו. Polyscan v.3 יש שיעור גבוה יותר שווא מוטציה חיובית SNPs (96%) ופחות עבור INDELs (93%). PolyPhred v.6 לא זיהה את רוב INDELs נכון, אבל יש שיעור שווא מוטציה חיובית (עבור INDELs) נמוך יותר הכולל v.3 Polyscan (90%). אנחנו צריכים להסיר את האפשרות של גילוי SNPs עבור Polyscan v.3 ולשמור הן PolyPhred v.5 ו PolyPhred v.6 לאיתור חלופה. המודד המוטציה Polyscan טובים לאיתור indels. הערה: האפשרות של גילוי SNP לא צריך להיות מיושם כאשר באמצעות Polyscan. רק "indel" האופציה צריך להיות. Polyscan שנוצר חיובי כוזב רבים לאיתור SNP.
      2. עבור exonic כל גרסאות ייחודי רומן זוהה, לאשר אותה באופן ידני על ידי reamplifying שבר ו resequencing proband ואת שני ההורים באמצעות primers הפוכה קדימה כדי לחסל כל חפץ טכנית.
2. שלמות exome רצף
   גישה זו מהווה רצף תפוקה גבוהה מיקוד רוב קידוד אזורים של הגנום האנושי. עכשיו אנחנו כרגע באמצעות הגישה החדשה הזו במעבדה שלנו, להאיץ את הגילוי של גנים מועמדים פוטנציאליים.
   1. הצו "SureSelect אקסון כל אדם" מיקוד האזור קידוד של מעל 16,000 הגנים (50 MB של הגנום) תוכנן על ידי Agilent או כל מוצר דומה אחר על ידי אחרים כמו רוש. לפני הסדר ערכת ללכוד, פלטפורמות סידור צריך לקבוע (Illumina לעומת מוצק).
   2. האם ללכוד פי פרוטוקול Agilent
   3. רצף המוצר בהתאמה פלטפורמת הדור הבא שלך זמין
   4. Variant זיהוי של רצף exome שלם: מספר כלי ביואינפורמטיקה עבור איתור genotyping של וריאציות הגנומי של פלטפורמת הדור הבא של רצף זמינים כגון BWA, Bfast, BioScope אשר יבצע את היישור. לאחר מכן כלים נוספים במורד זמין בחינם (לדוגמה SAM כלים, Varscan, Annovar) יהיה צורך זה להתקשר ביאורים גרסאות. תוכנה מסחרית המשלבת יישור רצף וקראו וריאנט ו ביאור זמינים גם כגון, NextGen (Softgenetics), CLC ביו ועוד

4. סדרי עדיפויות משתנים הגנום

וריאנטים שזוהו הן עדיפות אז למעקב על פי ההסתברות שלהם להיות דה נובו ו מזיקות לתפקד חלבון או mRNA ו / או מבנה. גרסה מעקב העדיפויות לגילוי גרסה נובו דה אמור להיות כך:

1. וריאציות ייחודיות (צפו פעם מקרה אחד)
2. וריאציות לא נוכחים ההורים
3. חלבון-מקצץ וריאציות: שטויות, indels המוביל frameshift ומוטציות שחבור.
4. וריאציה Missense ושקט חזו להיות הרסנית מבחינה תפקודית (למשל, להשפיע על שחבור mRNA). שימוש, Polyphen לנפות ו הפנתר עבור השפעה תפקודית על חיזוי החלבון.

אם באמצעות רצף exome שלם, מבחר של גנים מועמדים יכולה לשמש כאסטרטגיה עבור גרסאות עדיפות למחקר נוסף.

5. גנטית אימות

1. Resequence את הגן כולו במקרים חולה נוסף (כדי לזהות מוטציות סיבתי אחרים) שולטת. דגימות השליטה ישמש להעריך תדרים allelic של וריאנטים עדיפות. כל גן המכילים לפחות שתי שונה דה נובו מוטציות מזיקות (שחבור שטויות, frameshifts, וחזה missense מזיק) מצאו אצל חולים שונים (אך לא בדגימות שליטה או מאגרי מידע ציבוריים) צריכה להיות עדיפות גבוהה ללימודי אימות נוסף. זה כולל: 1) בדיקת פגם שחבור פוטנציאליים lymphoblastoid שורות תאים שמקורם בחולה. מניסיוננו, רוב הגנים תשואה RT-PCR מוצרים שורות תאים lymphoblastoid; 2) לחקור שינו ביטוי רמות חלבון על ידי ניתוח כמותי כתם המערבי של תמציות חלבון מן שורות תאים lymphoblastoid ו 3) מבחן נוסף המוטציה / גן ברמה תפקודית חיים (ג elegans, דג הזברה) וקו תא מודלים כמו שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו (לשעבר: 5,6).

6. נציג תוצאות:

בעקבות פרוטוקול זה, הצלחנו לזהות גנים חדשים סכיזופרניה ואוטיזם. דוגמה אחת היא גילוי לאחרונה SHANK3 הגן שלנו (איור 2). שני שונות דה נובו מוטציות בגן SHANK3, מוטציה אחת שטויות נמצא אחיו three מושפעים מוטציה אחת missense ב נקבה זו שנפגעה.

איור 2. (א) הפרדה של המוטציה שטויות R1117X בשלושה אחים מושפעים המשפחה PED 419. Proband מסומנת על ידי החץ. (ב) הפרדה של המוטציה missense R536W ב proband אך לא אחי לא השפיע עליה PED 56.

Discussion

ההליך המתואר כאן שואפת לזהות מחלות נפוצות ספציפיות התוצאה הסבירה, בין השאר, מן מוטציות דה נובו, וכדי להוכיח את ההשערה הזאת. דה נובו מוטציות הן מנגנון מבוססת היטב על פיתוח של מספר מחלות, למשל תסמונות סרטן תורשתיות, אך נחקר גרוע מחלות נפוצות. זה בתוצאות חלק מן האתגרים הטכניים הכרוכים לזיהוי מוטציות דה נובו, אשר מחייב את רצף של כמויות גדולות של DNA, אשר רק לאחרונה להיות חסכוני עם כניסתו של רצף הדור הבא. בנוסף, דה נובו שיעור המוטציות בבני אדם היה, עד לאחרונה, אומדן בלבד. רק לאחרונה יש שם דיווחים ישירות בקביעת שיעור המוטציות בבני אדם. לפני מדידות אלה, קשה היה לחזות את גודל המדגם הנדרש לסוג זה של המחקר כדי לקבוע אם נצפה דה נובו שיעור המוטציות גדול משיעור הבסיס. סידור גנים מועמדים לעומת הגנום כולו? מאחר שרוב המוטציות במחלה דיווחו הם missense / שטויות מוטציות הן באתר אחוי מוטציות (על פי אתר האינטרנט HGMD) אסטרטגיה ההקרנה שלנו היה לזהות מעל 68% של מוטציות ידועות. יש גם קשר ברור בין חומרת החלפת חומצת אמינו ואת הסבירות של פנוטיפ קליני. לעומת החלפת חומצת אמינו שמרני, שינוי שטויות 9.0 פעמים סביר יותר להציג קלינית 7. לפיכך, בשלב זה גנים מועמדים רצף היא האסטרטגיה העלות האפקטיבית ביותר.

ההצלחה של ההליך המתואר תלוי כמה שלבים קריטיים, אשר מתוארים בפירוט ואייר באמצעות שתי דוגמאות, אוטיזם וסכיזופרניה. ישנם מכשולים רבים אשר צריך להימנע, כגון מחלה שבה בחר, אשר מטופלים למקור המסך של ה-DNA, ופירוט כיצד ביעילות לזהות את המוטציות דה נובו. אנו מספקים שיטה יעילה ביותר בקביעת חלק מן המקרים של כל מחלה הנובעת מוטציות ספונטניות כאלה.