שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Summary

הדרך ללמוד את השילוב של היילוד תאים גרגר משוננת בבעלי חיים מבוגרים מתואר. טכניקה זו משתמשת רטרווירוס מהונדסים תווית נוירונים היילוד, ואחריו הקלטות אלקטרו לקבוע אינטגרציה תפקודית vivo.

Abstract

Neurogenesis מתרחש במוחם של יונקים בוגרים באזור חדרית המשנה (SVZ) של החדר לרוחב באזור תת פרטנית (SGZ) של gyrus משוננת בהיפוקמפוס לאורך כל החיים. דיווחים קודמים הראו כי neurogenesis בהיפוקמפוס מבוגר קשורה בהפרעות מוח שונים, כולל דיכאון, אפילפסיה, סכיזופרניה וחרדה (1). פענוח תהליך של שילוב בוגרים שנולדו נורמלי סוטה נוירון עשוי לשפוך אור על האטיולוגיה של מחלות אלו ולהודיע ​​פיתוח טיפולים חדשים.

Neurogenesis SGZ מבוגר מראות התפתחות עובריים עצביים שלאחר הלידה, כולל שלבי מפרט הגורל, הגירה, אינטגרציה סינפטית, והתבגרות. עם זאת, אינטגרציה מלאה מתרחשת על פני תקופה ארוכה 6 שבועות,. הקלט הסינפטי הראשונית מבוגר יליד תאים SGZ גרגיר משוננת (DGCs) הוא GABAergic, ואחריו קלט glutamatergic ב 14 ימים (2). גורמים ספציפיים המווסתים את היווצרות מעגל של מבוגר יליד נוירונים gyrus משוננת כרגע לא ידוע.

המעבדה שלנו משתמשת שכפול מחסר וקטור retroviral מבוסס על נגיף Moloney Murine לוקמיה לספק חלבונים פלורסנט גנים רגולטוריים שיערו תאים אלה מתרבים. טכניקה זו מספקת סגוליות ויראלי ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח של תאריך הלידה התא, שושלת, מורפולוגיה, ו synaptogenesis.

ניסוי טיפוסי לעתים קרובות מעסיקה שניים או שלושה וירוסים המכיל תווית ייחודית, transgene, ואלמנטים האמרגן לניתוח תא בודד של תהליך התפתחותי הרצוי in vivo. פרוטוקול הבאה מתארת ​​שיטה לניתוח נוירון תפקודית שילוב היילוד באמצעות ירוק אחד (GFP) או אדום (dTomato) רטרווירוס חלבון פלואורסצנטי ו-clamp תיקון electrophysiology.

Protocol

1. הזרקת וירוס

High-titer רטרווירוס מהונדסים (1 × 10 ⁹ יחידה / ml) מופק על ידי transfection משותפת של וקטורים retroviral ו VSVG לתאי HEK293T, ואחריו ultracentrifugation של supernatant ויראלי. עבור מקורות ושיטות הייצור, לראות את ההפגנה יופיטר מעולה (3).

הערה: מבוגרים צעירים (4-6 שבועות) נקבה C57Bl / 6 עכברים (Charles River) הם שוכנו בתנאים סטנדרטיים. כל הנהלים לעקוב מדריך הלאומית למחקר של המועצה לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה תחת פרוטוקול שאושר על ידי Stony Brook University IACUC.

1. הפשירי 2ul של רטרווירוס קפוא לכל בעל חיים על הקרח.
2. לטשטש (100 מיקרוגרם קטמין + 10 xylazine מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף) ואת הר החיה על מסגרת stereotaxic (Steolting). הסרת שיער על הראש ולנגב את העור עם אתנול 70%.
3. לחשוף את הגולגולת לקדוח ארבעה חורים רדודים באמצעות מקדח שיניים (0.6mm המקדח) בשעה מרכזת את הפעולות הבאות:
   • anterioposterior = -2 מ"מ מן גבחת; לרוחב = ± 1.6 מ"מ; הגחון = 2.5 מ"מ; anterioposterior = מ -3 מ"מ גבחת; לרוחב = ± 2.6 מ"מ; הגחון = 3.2 מ"מ.
   • anterioposterior = -2 מ"מ מן גבחת; לרוחב = ± 1.6 מ"מ; הגחון = 2.5 מ"מ; anterioposterior = מ -3 מ"מ גבחת; לרוחב = ± 2.6 מ"מ; הגחון = 3.2 מ"מ.
4. הר המילטון 1μl, שטוח קצה מזרק להזריק 0.5 רטרווירוס μl לכל אתר בשיעור של μl 0.25 / דקה לתוך gyrus משוננת. (ראו את הקואורדינטות לעיל עומק הגחון.) 2 השהה דקות לאחר ההזרקה לפני כל נסיגה לאט את המזרק כדי למנוע backflow נוזל. בין זריקות, בקצרה לשטוף את המשטח החיצוני של קצה המזרק עם PBS סטרילית המוליך כדי להסיר עקבות של דם.
5. סגור את הפצע עם חומר סטרילי תפר כירורגי (סוג P-1; גודל 6-0) ולהחזיר את בעל החיים בתנאי דיור סטנדרטית עד לשלבים הזמן הרצוי לאחר ההזרקה.

2. פורסים הכנה

כדי להשיג איכות גבוהה פרוסות חריפה של עכברים בוגרים, אנחנו משתמשים בפתרון חיתוך שונה להכנת פרוסה (ראה להלן).

1. טרום צמרמורת חיתוך פתרון 0-4 מעלות צלזיוס על הקרח בועה עם 95% -5% O ₂ CO ₂ במשך 30 דקות לפחות.
2. לטשטש ו transcardially perfuse חיה עם פתרון חמצן רווי קר כקרח חיתוך.
3. להסיר במהירות את המוח לתוך צלחת פטרי עם נייר סינון, טרום הרטובות עם פתרון, קר חיתוך מחומצן. לנתק את המוח הקטן ואת פרוסה משטח הרכבה לפחות הקדמי 1mm לקואורדינטות (גלוי) את הזריקה. דבק המוח לבמה vibrotome ו הר זה לתוך תא חיתוך מלא פתרון חיתוך קר מחומצן.
4. הכנת פרוסות העטרה או אופקיים (300 350μm) ולהעביר אותם עם פיפטה גדול נשא אל חדר דוגרים המכיל בטמפרטורת החדר ACSF מבעבע עם 95% O ₂ / 5% CO _2.
5. דגירה את פרוסות, מבעבעים ללא הרף, על 32 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. החזר את תא לטמפרטורת החדר למשך ההקלטה.

3. אלקטרו ניסויים

1. Slices מועברים לתא הקלטה אשר perfused ברציפות ב 32 ° C עם ACSF חמצן רווי - 34 ° C.
2. אלקטרודה טונגסטן דו קוטבית גירוי ממוקם השכבה המולקולרית של gyrus משוננת באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה אובייקטיבי (10X).
3. DGCs יילוד באזור תת פרטנית / שכבת תאים גרעיניים מזוהים ביטוי ה-GFP או dTomato. Whole-cell הקלטה patchclamp מבוצע על נוירונים היילוד בהגדלה גבוהה (40X).
4. מאפייני ירי של תאים רשמה מתקבלים על ידי הזרקה של סדרת זרמי תחת מצב מהדק הנוכחי.
5. גירויים חשמליים מועברים על ידי האלקטרודה גירוי באמצעות המבודד גירוי נשלט על ידי תוכנת הקלטה, עורר זרמים postsynaptic ב DGCs הילוד נרשמים.

4. ניתוח נתונים

אמפליטודות התגובות postsynaptic עורר מנותחים בשלבים התפתחותיים שונים של מבוגר יליד נוירונים.

5. נציג תוצאות

שימוש בפרוטוקול לעיל, ביטוי של GFP ב היילוד נוירונים gyrus משוננת דומה איור 1 נפוץ. שים לב נוירונים היילוד הם דמיינו בקלות הן דנדריטים ואקסונים מסומנים וחסונה. הביטוי אקסונים DGC דק קוצים קטן תלוי באיכות titer של הנגיף, מקדם בשימוש, אורך בביטוי vivo. בידיים שלנו, תאים היילוד המשנה הסלולר האברונים הם בדרך כלל גלויים בתוך כמה ימים לאחר ההזרקה, וביטוי עמוד השדרה ניתן לייחס החל מהשלבים המוקדמים של הפיתוח. Wחור תא הקלטות מתא עצב הנולד בשלבי זמן שונים לאפשר את לימוד ייחודיים המאפיינים תאים שזה עתה נולד, פוטנציאל פעולה כגון (איור 2 א), וכן את תהליך האינטגרציה הסינפטי לתוך מעגלים עצביים הקיימים במהלך ההבשלה (איור 2b).

איור 1 2 פוטון תמונה confocal של נוירונים היילוד בסעיף gyrus אופקי משוננת עכבר מבוגר. תאים הירוק 21dpi (ימים שלאחר הזריקה) GFP-לבטא DGCs היילוד שכותרתו עם רטרווירוס pUX-GFP.

איור 2 ב) פעולה פוטנציאל ירי המאפיינים של DGC בן יומו ב 21 dpi.) נציג עורר זרמים postsynaptic מעוררים (EPSCs) נרשם על DGC בן יומו ב 21 dpi.

Discussion

Neurogenesis רציף בהיפוקמפוס של מוח היונקים מבוגר מספקת מערכת ייחודית במודל ניסיוני ללמוד פיתוח ואינטגרציה עצב במוח הבוגר. הפרוטוקול המובא כאן משלב תיוג retroviral ושיטות אלקטרו ללמוד את השילוב של היילוד נוירונים גרגיר משוננת במוחם של עכברים בוגרים.

על מנת להבטיח כי הניסויים שלך מצליחים, אנו ממליצים הבאים במהלך השלבים הקריטיים של ההליך:

כדי למנוע זיהום דלקת לא רצויים, כל הכלים צריכים להיות מעוקרים (על ידי מעוקר, כל סוג של מעקר, או אתנול 70%) לפני הניתוח. השתמש PBS סטרילית כדי לשטוף את קצה מחט המזרק לפני ההזרקה.

עבור זריקה וירוס, בעלי חיים חייב להיות מותקן גם על המכשיר stereotaxic ומקורות תנועה מיותרת חייב להיות ממוזער במהלך ההזרקה. ודא הראש מקובע היטב במשרד, ולהתאים את המיקום האף של העכבר לרמה גבחת ו למבדה לפני הזריקה חישוב קואורדינטות. תמצית וירוס לתוך המזרק במהירות כדי לצמצם את החשיפה לטמפרטורות החדר - הטמפרטורה רטרווירוסים הם רגישים במיוחד. הזרק וירוס לאט בקצב מומלץ למזער את הנזק הלחץ. שימוש מומלץ שקצהו שטוח מזרק (לעומת קצה משופעים משותף) יבטיח שטח מופץ באופן שווה משוננת זיהום gyrus.

לפני הכנת פרוסות, חיתוך פתרון דוגרים ACSF חייב להיות מבעבע עם 95% O ₂ CO ₂ -5% במשך 30 דקות לפחות, כדי לאפשר לחמצן כדי להרוות את הפתרונות. בעלי חיים צריכים להיות perfused במהירות רקמת נשמר בתמיסה קר חמצן רווי, איכות פרוסה הטוב ביותר.

עבור הקלטה, להגביר את עוצמת הגירוי בהדרגה עד אין תגובה postsynaptic. שינוי מיקום האלקטרודה גירוי בתוך השכבה המולקולרית של gyrus משוננת לפי הצורך.

לסיכום, הגישה המומלצת מציעה דרך לחקור תכונות שונות ותפקידים תפקודית אפשרית של מבוגר יליד נוירונים במהלך האינטגרציה בשלב מוקדם לתוך המעגלים, פעיל בוגרת.

Materials