בצפיפות גבוהה הקלטות EEG של העכברים לנוע בחופשיות באמצעות polyimide מבוססי microelectrode

Summary

במאמר זה, אנחנו יכולים לתאר את הליך הניתוח והטיפול טיפים להשתלה של מערך polyimide מבוססי דקים microelectrode (PBM-array) בגולגולת עכבר לרכישת encephalography צפיפות גבוהה (EEG) במודל של עכברים.

Abstract

אלקטרואנצפלוגרם (EEG) מציין את הפעילות החשמלית ממוצעים של אוכלוסיות נוירונים ברמה בקנה מידה גדול. הוא מנוצל באופן נרחב ככלי ניטור פולשני המוח מדעי המוח הקוגניטיביים, כמו גם כלי אבחון אפילפסיה הפרעות שינה נוירולוגיה. עם זאת, המנגנון הבסיסי של דור קצב ה-EEG הוא עדיין תחת הצעיף. הציג לאחרונה polyimide מבוססי microelectrode (PBM-array) עבור העכבר ברזולוציה גבוהה EEG ¹ הוא אחד הניסויים כדי לענות על השאלות neurophysiological על אותות EEG מבוסס על משאבים גנטי עשיר כי המודל העכבר מכיל לניתוח תהליך מורכב דור ה-EEG. זה יישום של מערך-PBM nanofabricated לגולגולת העכבר הוא כלי יעיל לאיסוף בקנה מידה גדול הפעילות המוחית של העכברים הטרנסגניים ו מתאים כדי לזהות את וקושרת עצביים לקצב EEG מסוימים בשילוב עם התנהגות. עם זאת עובי אולטרה דקים שלה מבנה מפוצלת לגרום בעיות בטיפול השתלת מערך-PBM. בסרטון שהוצג, הכנה לניתוח הצעדים להשתלה של מערך-PBM על גולגולת עכבר מתוארות צעד אחר צעד. טיפול וניתוח טיפים שיעזרו החוקרים להצליח ההשתלה ניתנים גם.

Protocol

1. תקציר

C57BL/6J - עכברים 129S4/SvJae היברידית (12 ~ 15 שבועות) מורדמים עם קטמין (120 מ"ג / ק"ג IP) xylazine (6 מ"ג / ק"ג, ip) קוקטייל. צובט זנב או הבוהן מקדים את הניתוח כדי לבדוק את עומק ההרדמה. העכבר הוא קבוע על ידי מנגנון stereotaxic (דוד Kopf מכשירים, דגם 902, כליף, ארה"ב). הקרקפת הוא חרות על קו האמצע על 25 מ"מ על מנת לחשוף את הגולגולת תחת הטיפול לידוקאין להפחתת הכאב. פסולת על כל הגולגולת היא ניגבה על ידי מלוחים ספוג כותנה טיפים כדי לשפר את ההיענות של האלקטרודה אל הגולגולת. נקודות גבחת ו למבדה מסומנים ולהגדיר במישור האופקי אותו. מערך polyimide microelectrode מבוסס (PBM-array) ממוקם כך קו האמצע האנכי שלו פוגש את קו האמצע של הגולגולת. הנקודה גבחת צריך להיות ממוקם באמצע של שכבת ^ה -5 של הקדמי של המערך-PBM. שניים או שלושה microscrews משמשים בחלל ריק בקצה הגולגולת כדי לעזור לאבטח את המיקום של האלקטרודה במלט שיניים. עבור השעין את מחבר PBM מערך, אנחנו בעמדה יתד על אמצע הראש, לכסות אותו במלט שיניים. לאחר ריפוי העור חרות היא sutured, ולפחות 5 ימים ניתנים לשחזור. במהלך ההתאוששות, העכברים הם שוכנו בכלובים בודדים עם גישה חופשית מזון ומים. לאחר התאוששות, הקלטה EEG מבוצע. נהלים לטיפול בבעלי חיים, ניתוח, ורישום היו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש, בעקבות חוק 1992 של מעבדה Care קוריאה תקנות והנחיות הקשורים בבעלי חיים. PBM מערכים בכתב היד הזה היו מפוברקות כפי שתואר על ידי צ'וי. et. אל. ¹ אנא צרו קשר עם הכותבים להשתמש באותו PBM-מערך של וידאו.

2. נוהל

1. הכינו את מכשירי ניתוח עיקור ומכשירים stereotaxic.
2. להרדים את העכבר עם הרדמה (למשל, קטמין / xylazine עם מינון של 120 ו - 60 מ"ג / ק"ג ip, repectively). צובט זנב או הבוהן מקדים את הניתוח כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
3. הר את העכבר על המנגנון stereotaxic ידי הצבת פסי האוזן לתוך תעלת האוזן של העכבר והידוק אותו במקום. העיניים יכול להיות מכוסה ג'לי ביולוגית (למשל, וזלין) כדי לשמור על העיניים מפני התייבשות לאור הניתוח. לאחר לחות ראשו של עכבר עם אתנול 70%, לגלח את הפרווה מעל הראש.
4. לחתוך את הראש על 25 מ"מ עם הקרקפת. זה recommendable להחיל כמות קטנה של 2% לידוקאין הידרוכלוריד תחת הקרקפת. לצבוט את העור עם מהדק מיקרו (כלים המדע פיין (ארה"ב), Inc 18052-03 שבקליפורניה, ארה"ב) כדי לשמור על החתך פתוח לרווחה.
5. נגב כל פסולת רקמות שנותרו בגולגולת עם מלוחים ספוג ספוגיות כותנה לשפר את ההיענות של מערך-PBM אל הגולגולת. באמצעות חמצן להסרת שאריות של הקרום הוא גם יעיל.
6. מצא את גבחת נקודות למבדה על הגולגולת, ולסמן אותם עם עט על בסיס שמן הסמן. מניחים את PBM מערך כך קו האמצע האנכי שלו פוגש את קו האמצע של הגולגולת כפי שמוצג באיור 1. מקם את גבחת באמצע שכבת ^ה 5 של הקדמי של המערך-PBM עם טיפה אחת של מי ברז. ספוגית האלקטרודה הסרט המדיאלי עד לרוחב בזהירות לדבקות טוב יותר. כדי לעזור את האלקטרודה הסרט מקל הדוק לגולגולת, את האלקטרודה הסרט צריך להיות יבש לחלוטין על הגולגולת. אלקטרודה הסרט נותר קבוע על הגולגולת בכוח ואן דר ואלס. כאשר מיצוב מחדש את האלקטרודה, עוד טיפה של מי ברז הוא הכרחי על מנת למנוע את האלקטרודה מלהיות קרועים.
   
   באיור 1. (משמאל) PBM מערך בגולגולת העכבר. הציר anterio-האחורי של מערך-PBM תואם את הקו בין גבחת (BP) ונקודות למבדה (LP). (מימין) אלקטרודה עמדות המשוערת על פני השטח במוח העכבר. האנטומיה של העכבר הם מפולח של 3-D באתר MRI אטלס דיגיטליות של המוח המבוגר C57BL/6J עכבר המיוצר במעבדה הלאומית ברוקהייבן ואת האלקטרודה במקומות מסומנים על פי המדידה stereotaxic. קרקע (G) הפניה (שופט) אלקטרודות מסומנים באיור מימין.
7. סמן לפחות שלוש עמדות על שטח פתוח של הגולגולת, ואז לעשות חורים במיקומים אלו באמצעות מקדח שיניים עבור מיקום של microscrews תמיכה. Microscrews אלה יש תפקיד הכלונסאות ואת מכנית תמיכה הבטון שיניים בגולגולת. זהירות נדרשת במהלך הקידוח. מאז גולגולת עכבר מורכבת של שכבות דקיקות, דימום יכול להתרחש בקלות במהלך הקידוח. כאשר מתרחש דימום, להפסיק קידוח להחיל כמות קטנה של אבקת עוצר דמום לתוך החור.
8. יש ליישם את מלט אקרילי שיניים (ורטקס, שיניים, ורטקס עצמית אשפרה, הולנד) כדי לכסות את מערך PBM, ברגים עוגן, ואת שאר הגולגולת. הכנת מלט שיניים ג דביק וצמיגondition.
9. מיקום מקל נוקשה כמו יתד על אמצע הראש באמצעות דבק חזק (למשל, Loctite, הנקל Loctite Corp, דבלין, אירלנד). שים דו צדדית דבק בצד האחורי של המטוס המחבר. לתפעל את העמדה PBM מערך כדי לחבר עם קצה יתד. המרחק האנכי בין הגולגולת לבין מחבר צריך להיות יותר מ 5 מ"מ. סטיק המטוס מחבר את קצה המקל באמצעות דבק חזק הדבקה טובה יותר.
10. ודא כי מלט שיניים הוא נרפא לגמרי. ואז ליישם את מלט אקרילי שיניים על הגולגולת ואת הישבן של המטוס מחבר כדי לאבטח את מחבר את הגולגולת.
11. הסר את מהדק מיקרו. תפר חרות העור עם סיבים תפרים מעוקרים. הסר את העכבר מן המנגנון. אתה רשאי לבקש תוספת אקריליק צמנט שיניים כדי לגונן על הגולגולת חשוף. החלת (משחה fucidin, דונג ממ לרוקחות, דרום קוריאה), אנטיביוטיקה סביב הבטון ועור sutured.
12. מניחים את העכבר בכלוב מעוקרים עד משחזרת משקל הגוף המקורי (בערך 5 עד 7 ימים). מומלץ לא להכניס כל חבריהם לכלוב.
13. לאחר התאוששות, לחבר את העכבר על ידי מחבר קל משקל מעגלים מודפסים (PCB) הלוח headbox של מערכת מגבר רב ערוצי EEG (Synamps ^2, צפון קרוליינה, ארה"ב) בכלוב משלה. הקווים המחברים יש להתייחס בזהירות כדי שלא להסתבך.
14. אחרי שעה של התרגלות 1, לבצע הקלטה EEG. סריקה 4.4. (צפון קרוליינה, ארה"ב) תוכנה הרכישה נעשה שימוש בניסוי זה. זמן אופייני לאתר קבוצה של עכבר ה-EEG מוצג באיור 2. מומלץ יומן וידאו להתייחס להתנהגות של העכבר.
15. האות המתקבל ניתן לנתח על ידי MATLAB (MathWorks, Natick, מסצ'וסטס, ארה"ב) כדי לייצר את המפה הטופוגרפית המוח. Topographies מדגם של מפת הכוח של המוח EEG העכבר מוצגים באיור 3.

3. נציג תוצאות

אם ניתוחים לעיל מתנהלים כראוי, 40 ערוצי הקלטה עכבר EEG תבוצע בהצלחה ללא ערוצי רע. התמונות הבאות מציגות את עקבות נציג EEG גלם מפות טופוגרפיות.

איור 2. עקבות מדגם של התקף EEG בהעדר חווה המושרה על ידי הזרקת γ-butyrolactone (GBL, 50mg/kg, ip). רד בר מציין ספייק-גל שחרורים (SWDs) במהלך התקף היעדרות. צירים אופקיים ואנכיים מצביעים הזמן מתח, בהתאמה. מספר עוקב אחר מונטאז' ערוץ מוגדרים באיור. 1 (מימין).

איור 3. מפות טופוגרפיות לציין את חלוקת הכוח 2-6 הרץ. הערך colorbar מייצג את סולם הצבעים של המפה לשלטון. במהלך גל ספייק הפרשות (SWDs) הנגרמת על ידי γ-butyrolactone (GBL, 50mg/kg, IP), את הכוח באזורים קורטיקליים frontoparietal גדול משמעותית לעומת הכוח לפני הזריקה GBL (Baseline).

Discussion

כאן אנו מדווחים ניתוחים הקלטה לרכוש צפיפות גבוהה ב-EEG נע בחופשיות עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו להשיג מפות מוח תפקודית ממודל העכבר ללמוד המנגנונים המולקולריים של ^1,2 קצבית ספונטנית או פעילויות הקשורות לאירוע מוחי.

רכישת כל הערוצים במערך-PBM הוא תנאי הכרחי כדי להשיג מיפוי המוח כולו, אך מה שהופך איש קשר מאובטח עבור כל ערוץ הוא מאתגר מאוד. כדי לשמור על קשר עקבי של ערוץ אל הגולגולת, נהלים הבאים נמצאים להיות חשוב. קודם כל, כל פסולת רקמה על הגולגולת עשוי להגדיר בנפרד את האלקטרודה מהגולגולת. לכן חשוב מאוד להסיר את כל פסולת רקמה עם צמר גפן יבש לעקר את פני הגולגולת. שנית, היכולת של מערך-PBM אשר יכול להיצמד למשטח הגולגולת הוא כוח ואן דר ואלס. מומלץ ליישם טיפת מים ברז בגולגולת לבנות שכבת מים לפני אחד להחיל PBM-מערך הגולגולת. שלישית, צמיגות הימני של מלט השיניים חשובה מאוד. אם היא נוזלית מדי, הוא עלול לבנות שכבה מבודדת תחת מערך-PBM. אם הוא סמיך מדי, מלט שיניים יהיה בקלות להתפרק מהגולגולת בשל משקל משלה. לבסוף, לפחות שלוש microscrews תמיכה צריך להיות מושתל בגולגולת על מנת להפוך את המלט שיניים הדוק לגולגולת. Microscrews תמיכה להחזיק את המלט שיניים לאבטח את headstage, שהוא חיוני למחקר ארוך טווח.

היישום של מערך-PBM יהיה מוגבל ללמוד כרונית עם עכברים בוגרים בשל גודלו ומשקלו. בהתבסס על הניסיון שלנו, עכברים כבד יותר 25 גרם מספיקות לשימוש. כמו יישומים נוספים, בחלל ריק בין סניפים מערך PBM שלנו, אפשר להציג אלקטרודות משני להקלטה או גירוי מטרה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
γbutyrolactone	Sigma-Aldrich	H7629-500G