Assay Clonogenic: תאים חסיד

Summary

תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.

Abstract

Assay (או מושבה להרכיב) clonogenic הוקם במשך יותר מ 50 שנים; את הנייר המקורי המתאר את השיטה פורסמה בשנת 1956 ^1. מלבד המתעדים את השיטה, את המחקר ציון דרך הראשוני שנוצר כבר בסיבוב הראשון קרינה במינון התגובה רנטגן מוקרן (הלה) בתאי יונקים בתרבות ^1. ביסודו של דבר, assay clonogenic מאפשר הערכה של ההבדלים הכדאיות הרבייה (יכולת של התאים לייצר צאצאים, כלומר תא בודד להקים מושבה של 50 תאים או יותר) בין לתאי קבוצת הביקורת תאים שעברו טיפולים שונים כגון חשיפה כדי מייננת קרינה, תרכובות כימיות שונות (סוכני ציטוטוקסיות למשל) או במקרים אחרים מניפולציה גנטית. Assay הפך את הטכניקה המקובלת בביולוגיה קרינה כבר בשימוש נרחב להערכת רגישות לקרינה של שורות תאים שונות. יתר על כן, assay clonogenic נפוץ לניטור יעילות של תרכובות קרינה שינוי ו לקביעת ההשפעות של סוכני ציטוטוקסיות אחרות נגד סרטן ותרופות על היכולת להרכיב המושבה, שורות תאים שונות. ניסוי טיפוסי הישרדות clonogenic חסיד באמצעות קווי תאים כוללת שלושה מרכיבים נפרדים, 1) טיפול monolayer התא צלוחיות בתרבית רקמה, 2) הכנת תרחיפים תא יחיד ציפוי המספר המתאים של תאים בצלחות פטרי ו -3) תיקון ו מכתים המושבות לאחר תקופת דגירה רלוונטי, אשר יכול לנוע בין 1-3 שבועות, בהתאם לקו הסלולרי. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם שורות תאים חסיד עם השימוש של קו תאים אנושיים הנציח keratinocyte (FEP-1811) ^2. כמו כן, המטרות שלנו הן כדי לתאר תכונות משותפות של מבחני clonogenic כולל חישוב יעילות ציפוי שברים ההישרדות לאחר חשיפה לקרינה של תאים, וכדי להדגים שינוי בתגובה קרינה עם השימוש ניסוח נוגדי חמצון טבעיים.

Protocol

1. Cell התרבות ניסויית הקמה

1. קרטינוציטים האדם מתוחזקים כמו monolayers ב 75 ² ס"מ רקמות צלוחיות תרבות המכיל 15 מ"ל של keratinocyte-SFM (K-SFM) בינוני (GIBCO, סרום ללא בינוני) בתוספת L-גלוטמין (2 מ"מ), גורם הגדילה באפידרמיס (5 ng / mL), תמצית בלוטת יותרת המוח שור (40 מיקרוגרם / מ"ל) ו - 20 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין. התאים גדלים בסביבה CO humidified 5% ₂ ב 37 ° C.
2. תאים הם זורעים לתוך 12 x 25 ס"מ ² רקמות צלוחיות תרבות המכיל 5 מ"ל של מדיום K-SFM.

המתלים תא יחיד מוכנים ידי trypsinization. תאים נשטפים עם פוספט שנאגרו מליחים מודגרות עם פתרון טריפסין / EDTA 0.05% למשך 5-10 דקות. כאשר התאים מתחילים להיות מעוגלות ~ 30% מנותקים, 3 כרכים של מדיום שונה נשר של Dulbecco המכיל 10% בסרום שור העובר הוא הוסיף לנטרל את טריפסין. התאים מנותקים ידי pipetting למעלה ולמטה (20 פעמים). תאים נספרים באמצעות hemocytometer.

המספרים המתאימים תא זרע לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי (כ 20 שעות אדם FEP-1811 קרטינוציטים). המטרה היא להשיג confluency ~ 90% (~ 10 ⁶ תאים לכל בקבוק) ביום הניסוי.

הניסוי המורכב 12 צלוחיות הוא אופטימלי עבור assay clonogenic יחיד (שישה לשלוט unirradiated שש צלוחיות מוקרן) אשר יכול להסתיים כארבע שעות.

2. טיפול הקרנה

1. פנקו את התאים לזמן מתאים עם תרכובת קרינה שינוי רלוונטי לחשוף את התאים לקרינה מייננת או γ-קרינה או קרני רנטגן.

בדרך כלל six צלוחיות לשמש יעילות ציפוי (מטופל) בקרות סמים בלבד. אחרים שש צלוחיות הם מוקרן.

בדוגמה זו קרטינוציטים אדם מטופלים עם ריכוז שונים של Cinnulin PF (ע.מ.; בריאותיים Integrity הבינלאומי, ספרינג היל, טנסי, ארה"ב, נציג נתונים עבור 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​מוצג להלן), נוגד חמצון מסיס במים ניסוח טבעי, במשך שעה 1 בשעה 37 ° C. תאים הם מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min).

3. ציפוי

1. בעקבות הטיפול, השעיות תא בודד מתקבלים כמתואר לעיל.
2. מספר תאים מדגם זה נספרות בקפידה באמצעות hemocytometer ומדולל כך מספרים תא המתאימים seeded לתוך בצלחות פטרי (חמישה משכפל של כל 15 מנות מ"מ).
   יעילות ציפוי ו / או לשרוד צריך להיות חלק הצפוי כאשר מחליטים את מספר התאים זרע לכל צלחת. המטרה היא להשיג מגוון רחב של בין 20-150 מושבות.

צלחות פטרי מסודרים תיבת שיבוט humidified פלסטיק מודגרות בסביבת 5% CO ₂ ב 37 ° C להקמת המושבה.

זמן הדגירה של היווצרות במושבה משתנה בין 1-3 שבועות של שורות תאים שונות, מקובל כי הזמן חייב להיות שווה לפחות שש חלוקות. בדוגמה זו, את הכלים לשלוט על קרטינוציטים אדם דורשים שמונה ימים כדי ליצור שיבוטים מספיק גדול בהיקף של 50 תאים או יותר.

4. תיקון ו מכתים המושבות

השלם את השלבים הבאים ברדס קטר.

1. להסיר בעדינות את התקשורת מכל אחד הלוחות על ידי שאיפה.
2. לשטוף כל צלחת עם 5 מ"ל סליין 0.9%.
3. תקן המושבות עם 5 מ"ל פתרון נייטרלי 10% פורמלין שנאגרו במשך 15-30 דקות.
4. כתם סגול עם 5 מ"ל גביש 0.01% (w / v) ב DH ₂ O עבור 30-60 דקות.
5. לשטוף סגול קריסטל עודף עם DH ₂ O ולאפשר מנות לייבוש.

5. במושבה ספירת

Stereomicroscope

1. מושבות המכילים יותר מ 50 תאים בודדים נספרים באמצעות stereomicroscope.

הדמיה דיגיטלית ועוד היד נטויה באמצעות תוכנת הדמיה

1. תמונות דיגיטליות של המושבות מתקבלים באמצעות מצלמה או מכשיר סריקה
2. מושבות נספרים באמצעות ניתוח הדמיה חבילות תוכנה כמתואר להלן.

תא ספירה באמצעות ImageJ (פיג'י גרסה 1.44a)

1. פתח את קובץ התמונה בפיג'י, ללכת קובץ -> פתח.
2. אם יש צורך להמיר את התמונה לפורמט 8-bit, עבור Image -> התאם את סף ...->.
3. התאם סף כדי להפחית את רמות הרקע הלא ספציפית כך שרק מושבות מזוהים.
4. ספירת מושבות באמצעות הפעולות הבאות: ללכת תהליך - בינארי> -> מצא את מקסימום.

עבור פורמט התמונה, סובלנות רעש יכול להיות מוגדר 0. ודא כי האפשרות רקע האור מסומנת לצפות בתצוגה מקדימה של מקסימום זוהה כדי לבדוק שכל מושבות תאים נרשמו כהלכה.

Discussion

בדוגמה זו האדם FEP-1811 קרטינוציטים טופלו בריכוזים שונים של עד 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ע.מ., הנתונים הראו על 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ע.מ. שעה 1 ב 37 ° C. תאים בעקבות הטיפול היו מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min). בשביל לשלוט על טי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI Supplies	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon Instruments		Used to count colonies consisting of >50 cells.