Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

Summary

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים ( Saccharomyces cerevisiae) משתנה לאחר חשיפה סטרס חמצוני הנגרם על ידי תוספת של מי חמצן (H ₂ O ₂), סוכן חמצון.

Abstract

בפרוטוקול זה, ביטוי גנים שמרים (Saccharomyces cerevisiae) משתנה לאחר חשיפה סטרס חמצוני הנגרם על ידי תוספת של מי חמצן (H ₂ O _2), סוכן חמצון. בניסוי, שמרים הוא גדל במשך 48 שעות במרק YPD 1/2X המכילה גלוקוז 3X. התרבות מחולק שליטה וקבוצת טיפול. התרבות הניסוי שטופלו 0.5 מ"מ H ₂ O ₂ ב הנקס שנאגרו מלוחים (HBSS) במשך שעה 1. התרבות שליטה שטופלו HBSS בלבד. סך RNA מופק תרבויות והן מומר מוצר ביוטין שכותרתו Crna באמצעות תהליך רב שלבי. המוצר הסופי הוא סינתזה נלקח חזרה מתקן Core UVM microarray ו - הכלאה של GeneChips שמרים Affymetrix. הביטוי הנתונים וכתוצאה מכך גן מועלים לתוך תוכנת ניתוח הנתונים ביואינפורמטיקה.

Protocol

1. בידוד RNA סך של Saccharomyces cerevisiae באמצעות תמוגה אנזימתי

1. הכן אזור RNase ללא עבודה באמצעות RNase ZAP (Ambion).
2. הכן lyticase טרי מגיב העבודה על ידי הוספת 1 מ"ל של מים RNase חינם ישירות הבקבוקון lyticase לעשות פתרון העבודה הסופית של 10 U / ul. וורטקס היטב להפוך מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב מלא. זה 10 יחידות / μl פתרון יציב למשך 12 שעות.
3. הכן פתרון טרי DNase אני משתמש DNase Qiagen ערכת ולאחסן על הקרח.
4. לייבל 1.7 microcentrifuge מ"ל צינור עם פרטי זיהוי שלך. העברת 1.5 מ"ל של התרבות השמרים המתאימים לתוך הצינור.
5. צנטריפוגה התחתית 5000 XG (כ 3 / 4 מהירות מלאה) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את supernatant (ללא גלולה מטריד) באמצעות micropipette וזורקים supernatant.**** חזור על שלב 4 אם גלולה בגודל קטן מדי או אם מסומן על ידי מדריך .****
6. הוספת מים 1000 DEPC μl של גלולה, מערבולת, ו צנטריפוגות XG ב 5000 במשך 2 דקות. בטל supernatant. הסר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מן גלולה שמרים.
7. הוסף הבאה כדי גלולה את השמרים ואת המערבולת לערבב.
   
8. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
9. מערבולת בעדינות את הצינור כל 10 דקות כדי לייצר spheroplasts. Spheroplasts יש לטפל בעדינות. בדוק שמרים במיקרוסקופ כדי להתבונן spheroplasting להשלים. תוך בחינת שמרים בשקופית מיקרוסקופ, להוסיף כמות קטנה של 0.1% SDS לגרום שמרים לתפוח בצורת כדורים מושלמים (גם עבור תאים נביטה). זה מצביע על קירות התא כבר מעוכל.
10. הוסף 350 μl חוצץ ב-RLT אל הצינור מערבולת במרץ דקה 1. ודאו כי הצינור שלך כתרים בחוזקה על ידי מחזיק את המכסה סגור בעוד vortexing. הליך זה יהיה lyse spheroplasts.
11. הוסף 250 μl 100% אתנול אל הצינור מערבולת בקצרה. המשקע עלול להיווצר לאחר תוספת של אתנול, אבל זה לא ישפיע על אוסף של רנ"א.
איסוף RNA: טור ספין RNeasy עם זיהוי שלך informationand בזהירות להעביר את כל הפתרון משלב 10 לעמודה ספין באמצעות micropipette. היזהר שלא לגעת קרום סיליקה עם קצה pipet. סגור את צינור צנטריפוגות למשך 15 שניות במלוא המהירות. RNA במדגם תדבק הממברנה סיליקה הטור ספין.
12. הסר את העמודה ספין מהצינור האוסף. Pipet לעבור דרך הנוזל (הנוזל בצינור האוסף) חזרה אל הטור ספין צנטריפוגות שוב. מחק את צינור איסוף (עם הזרם דרך נוזל) והמקום טור ספין לתוך צינור חדש מ"ל 2 האוסף.
13. הוסף 350 μl חיץ RW1 לעמודה ספין. פתרון זה משמש כדי לשטוף את הרנ"א להסיר מלחים ופסולת הסלולר מומס. סגור את צינור צנטריפוגות למשך 15 שניות במלוא המהירות.
לעכל את ה-DNA: הסר את העמודה ספין של צנטריפוגות, פתח את מכסה שפופרת ולהוסיף 80 μl של פתרון אני DNase לאמצע הממברנה טור ספין. צעד זה יהיה לעכל כל gDNA במדגם. סגור את המכסה עמודה דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
14. העברת העמודה ספין כדי צינור חדש מ"ל 2 האוסף.
ניקוי ושטיפת RNA: הוסף 350 μl חיץ RW1 לעמודה ספין צנטריפוגות במלוא המהירות למשך 15 שניות.
15. מחק את צינור איסוף במקום טור ספין לתוך צינור חדש מ"ל 2 האוסף.
16. הוסף 500 μl חיץ הרשתית לעמודה ספין לשטוף את הרנ"א על ​​הממברנה סיליקה. סגור את צינור צנטריפוגות למשך 15 שניות במהירות מלאה.
17. מחק את צינור איסוף במקום טור ספין לתוך צינור חדש מ"ל 2 האוסף.
18. לשטוף את הממברנה סיליקה שוב על ידי הוספת עוד חיץ 500 הרשתית μl לעמודה ספין. סגור את צינור צנטריפוגות למשך 15 שניות במלוא המהירות.
19. הנח את הטור ספין צינור חדש מ"ל 2 איסוף צנטריפוגות ב microcentrifuge במלוא המהירות לרגע 1 כדי להבטיח כל נוזל שיורי יוסר הממברנה סיליקה.
שחזור רנ"א: העברת העמודה ספין RNeasy אל צינור חדש מ"ל 1.7 microcentrifuge כי כבר שכותרתו עם מידע המדגם שלך. שים לב כובע של הצינור החדש יישאר פתוח עוד כמה צעדים.
20. בזהירות 30 pipet μl RNase ללא מים ישירות על גבי במרכז של קרום סיליקה. אל תיגע קרום סיליקה עם קצה pipet (ראה תרשים). תראה מקרוב כמו שאתה לבצע שלב זה. השתמש בשתי הידיים כדי להנחות את pipet. ודא מים מופץ באופן שווה על הממברנה.
21. דגירה העמודה ספין בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. צנטריפוגה במלוא המהירות למשך 30 שניות.
22. בזהירות העברת μl 30 כי הוא התאושש בצינור 1.7 מ"ל חזרה אל המרכז של הממברנה סיליקה הטור ספין כמו בשלב 22 לעיל. מניחים את הטור בחזרה את הצינור אותו אוסף 1.7 מ"ל ו דגירה במשך דקה 1 בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דקה 1 במלוא המהירות. זה elution כפול מבטיח כי כמות מקסימלית של RNA הוא התאושש הממברנה.
שני חדש 1.7 מ"ל צינורות microcentrifuge עם מידע הזיהוי שלכם להעביר את כל המדגם RNA התאושש לאחד הצינורות האלה.
23. העברת 4 μl מדגם זה צינור שכותרתו אחרים. מדגם זה יועברו בחזרה UVM עבור Nanodrop כימות והערכה RNA איכותי (זה כדי לאמת ניתוח RNA כמותיים ואיכותיים שבוצעו באתר על השתתפות המכון).
24. שמים את כל דגימות על הקרח.
RNA כימות: שימוש Biophotometer Eppendorf, למדוד את ספיגת המדגם RNA על ספקטרופוטומטר בדילול 1-50 (מדגם 1μl 49μl + H ₂ O).
25. הערכת איכות RNA באמצעות E-Gel (Invitrogen) 1.2% precast ג'ל אלקטרופורזה עבור agarose.
RNA איכותי ניתוח: הגדרת מנגנון E-ג'ל אלקטרופורזה. טרום להפעיל את הג'ל למשך 2 דקות על פי הנוהל של היצרן. לאחר שלפני לרוץ, להסיר את המסרק ג'ל ולהוסיף 14 μl מים לכל אחריו היטב על ידי 1μl המדגם שכל טוב לכל. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. להשתמש בסולם מתאים DNA גודל באחד גם לצורך השוואה גודל מאוחר יותר (סולם קל ביוליין אני בגודל סטנדרטי או Novagen סמן PCR). הקלטת שבה המדגם הוא בנתיב אחד. הרץ את הג'ל למשך 20 דקות.
26. קח תמונה של הג'ל.

2. סטרנד סינתזה ראשון cDNA

1. לייבל 0.5 מ"ל צינור PCR עם פרטי זיהוי שלך. מתוך ריכוז של רנ"א נקבע מניסוי לעיל, לחשב את היקף המדגם כדי להשיג 3.0 UG. העברת סכום זה הצינור. הוסף מספיק RNase ללא מים להביא את נפח 11.0 ul.
2. הוספת 1.0 μl T7 אוליגו (DT) ₂₄ מגיב על הצינור. הקפידו להקדיש תשומת לב מיוחדת נפח קצה pipet במהלך שלב זה על מנת להבטיח כי כל מגיב הועבר. וורטקס את הצינור צנטריפוגות במלוא המהירות למשך 5 שניות. מניחים את הצינורית thermocycler סט ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. בעוד 70 ° C הדגירה מתבצעת, להכין את גדיל first מאסטר לערבב בצינור חדש. הקפידו להוסיף את ריאגנטים הבא לפי הסדר, מערבולת צנטריפוגות במלוא המהירות לרגע 5 והמקום צינור על הקרח.
   

SGbuffer	10 μl
Lyticasesolution (10u/μl)	30 μl

השתמש micropipette P2 למדוד כרכים של μl 2 או פחות.
27. לאחר 70 ° C הדגירה בשלב 2 תושלם, להוסיף 8 μl של תמהיל המתאר הראשונה גדיל שנעשו על שלב 3 כדי הצינור מדגירים את thermocycler ב 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. כאשר הדגירה first סינתזה גדיל נגמר, במקום צינור על הקרח. במהלך הדגירה זה, להכין את תערובת second מאסטר גדיל.

3. סטרנד סינתזה השנייה cDNA

1. הפוך את המאסטר הבא second גדיל לערבב בצינור חדש. שמור את זה על הקרח. וורטקס ו צנטריפוגות כל ריאגנטים לפני השימוש. מוסיפים את ריאגנטים לפי סדר הרשומים.
   

גדיל ראשון מאסטר מיקס:
FirstStrandBuffer5X	4 μl
0.1MDTT	2 μl
10mMdNTP	1 μl
SuperscriptII	1 μl

Ecoli Ecoli ה-DNA פולימראז I (10U/ul) Ecoli RNase H (2U/ul)
28. וורטקס את הצינור צנטריפוגות למשך 5 שניות במלוא המהירות.
29. כאשר 42 ° C הדגירה הוא סיים, להעביר את כל 130 μl של תמהיל זרם שני המאסטר הצינור מדגם המכיל את גדיל RNA ו ריאגנטים הראשון. וורטקס ו צנטריפוגות למשך 5 שניות בטמפרטורת החדר. דגירה צינור עבור 2 שעות 16 מעלות צלזיוס thermocycler.
30. בסוף הדגירה 2 שעה תוך המדגם הוא עדיין 16 מעלות צלזיוס, להוסיף פולימראז 2μl T4 מגיב דנ"א הצינור. בקצרה מערבולת בצנטריפוגה צינור לדגור על 16 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 5 דקות נוספות. דוגרים כבר אז 5 דקות עשויה להפחית את האיכות של cDNA בשל פעילות 5'exonuclease 3'to של פולימראז T4.
31. בסוף הדגירה של 5 דקות, להוסיף 10 0.5 μl M EDTA כדי לעצור את התגובה T4 DNA פולימרז. אחסן את הצינור ב -20 ° C.

4. מזרז cDNA

1. צנטריפוגה נעילת שלב שפופרת הג'ל במלוא המהירות למשך דקה אחת כדי להבטיח את הג'ל הוא בתחתית של התחתית. DO NOT VORTEX LOCK צינורות שלב.
2. הוסף 162 μl של השכבה התחתונה מ-pH 8.0-טריס בופר פנול / כלורופורם / Isoamyl אלכוהול (PCI) את התוכן של צינורית שנייה cDNA גדיל התגובה סינתזה מערבולת למשך 5 שניות כדי לערבב את תוכן (ההיקף הכולל של שלב הסינתזה cDNA מניסוי לעיל הוא 162 ul. השלב PCI דורש כמויות שוות של תערובות מימיות אורגני).
3. להעביר את כל התערובת cDNA-PCI כדי לנעול את הצינור בעזרת ג'ל שלב micropipet. לא VORTEX נעילת שלב שפופרת הג'ל.
4. צנטריפוגה במלוא המהירות במשך 2 דקות.
5. לייבל חדש microcentrifuge 1.7 צינור מ"ל. השתמש micropipet להעביר את השכבה העליונה של צינור נעילת שלב ג'ל אל הצינור 1.7 שכותרתו החדש מ"ל. נסו לאסוף כמה שיותר שכבת האפשרי.
6. הוסף הבאה כדי צינור 1.7 מ"ל microcentrifuge ו מערבולת.
   

גדיל שני הורים לערבב
DEPC מים	91 ul
5X סטרנד השנייה הצפת	30 ul
DNTPs (10mm)	3 ul
1 ul
4 אול
1 ul

האנזים דנ"א (10U/ul)
32. הנח את הצינור בצנטריפוגה עם ציר של הצינור הפונה החוצה צנטריפוגות במלוא המהירות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
33. בעדינות להסיר את הצינור מתוך בצנטריפוגה נזהר לא להפריע גלולה cDNA. גלולה צריך להיות ורוד בערך בגודל של גרגר של מלח בצד של הצינור תחת הציר. מניחים על קרח להמשיך מיד לשלב הבא.

5. ניקוי גלולה cDNA

1. שימוש micropipet P1000, להסיר בזהירות את כל supernatant מן הצינור. היזהר לא להפריע גלולה. זכור כי גלולה הוא מדגם שלך!
2. הוסף 500μl 80% אתנול קר (מאוחסן -20 ^° C במקפיא) אל הצינור. כובע בעדינות את הצינור להפוך את זה כמה פעמים לאט. צפה גלולה שלך מקרוב מאוד. אם גלולה הופכת מנותקת, במקום הצינור בחזרה במעמד ולתת גלולה ליישב לתחתית. לחלופין, ייתכן צנטריפוגות הצינור במלוא המהירות למשך 15 שניות כדי לקבל גלולה חזרה לתחתית של התחתית.
3. שימוש micropipet P1000, להסיר בזהירות אתנול נזהר מאוד לא להפריע גלולה. עצה הצינור כדי לאפשר הסרה של הנוזל ככל האפשר.
4. חזור על שלבים 2 ו -3 עם aliquot חדש של אתנול 80%.
5. לבסוף, להסיר את כל אתנול הניתן באמצעות micropipet P1000. צנטריפוגה הצינור במלוא המהירות למשך 5 שניות ושימוש micropipet P20, להסיר את מיקרוליטר האחרונים של אתנול. המטרה היא להסיר כמו אתנול האפשר מבלי להפריע גלולה.
6. הנח את הצינור פתוח במעמד או תיבת ייבוש עבור 10-20 דקות להתאדות אתנול הנותרים. גלולה יבשים הולך לאיבוד בקלות פעם הוא יבש. Becareful לטפל הצינור בעדינות. בסיום, לסגור את המכסה. דמיינו את גלולה יבשים כדי לאשר אותה נמצא הצינור.
7. Resuspend את הכדור ב 22 μl מים RNase ללא והמקום צינור על הקרח.

6. InVitroTranscription (IVT)

1. Bioarray אנזו ערכה המכילה את כל הדרוש כדי להכין ריאגנטים Crna שכותרתו ביוטין מ cDNA.
   Mixfor להשתלט על הכיתה יהיה מוכן כמדריך follows.The יכין זה לערבב או לייעד מישהו מהכיתה. זה חייב להיעשות באזור RNase-free.
   

אתנול (100%)	405 ul
NH 4 OAc	80 ul
גלולה Paint	1 ul

הערה:
34. לייבל צינור 0.5 מ"ל PCR. שלב הבא הצינור pipet מעלה מספר פעמים עד לערבב. ספין בצנטריפוגה במהירות מלאה למשך 5 שניות כדי לקבל את כל ריאגנטים לחלק התחתון של הצינור.
    

	Amt / מדגם	# דוגמאות	סך הכל
מגיב 1 [חיץ התגובה 10x]	4μl
מגיב 2 [Biotinnucleotides 10x]	4μl
מגיב 3 [DTT 10x]	4μl
מגיב 4 [10x אינהיביטור RNase]	4μl
מגיב 5 [20x T7-RNA פולימראז]	2μl
סך נפח	18 μl

הכן תערובת מאסטר די במספר דוגמאות ועוד אחד. זה יהיה לבטח מספיק למטרות pipetting.
35. דגירה התחתית 37 ° C for16 שעות thermocycler. כאשר התגובה היא מוחלטת, בחנות מדגם ב -20 ° C

7. ניקוי Crna Biotinylated

1. העברת המדגם קרנה כולה צינור microcentrifuge חדש 1.7 מ"ל. הוסף 60 μl מים RNase-חופשית 350 חיץ RLT מערבולת μl ו למשך 5 שניות.
2. הוספת 250 אתנול 100% מערבולת μl ושוב.
3. תווית עמודה ספין RNeasy ולהעביר את דגימת קרנה כולה לעמודה. היזהר שלא לגעת קצה pipet כדי הממברנה סיליקה. סגור את המכסה צנטריפוגות למשך 15 שניות במלוא המהירות.
4. הסר את העמודה ספין מהצינור האוסף. Pipet לעבור דרך הנוזל (הנוזל בצינור האוסף) חזרה אל הטור ספין צנטריפוגות שוב למשך 15 שניות.
5. הנח את הטור ספין לתוך צינור חדש מ"ל 2 איסוף pipet 500 μl של חיץ הרשתית על הטור ספין. סגור את צינור צנטריפוגות למשך 15 שניות במלוא המהירות. בטל צינור איסוף עוברים נוזלי. מניחים את הטור ספין לתוך צינור חדש מ"ל 2 האוסף.
6. הוסף חוצץ 500 הרשתית μl לעמודה ספין.
7. העברת העמודה ספין לתוך צינור האוסף החדש ולבצע טור "ייבוש" הספין במלוא המהירות במשך 2 דקות.
8. לייבל חדש microcentrifuge 1.7 צינור מ"ל עם פרטי זיהוי שלך. העברת עמודה ספין לצינור הזה.
9. 30 Pipet מים μl RNase חופשי על גבי קרום מרכז RNeasy סיליקה לדגור על טמפ 'החדר למשך דקה 1. סגור את צינור צנטריפוגות במשך דקה 1 במלוא המהירות.
10. בזהירות העברת μl 30 כי הוא התאושש בצינור 1.7 מ"ל חזרה אל המרכז של הממברנה סיליקה RNeasy הטור ספין זהה. מניחים את הטור בחזרה אל צינור איסוף זהה 1.7 מ"ל ו דגירה במשך דקה 1 בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דקה 1 במלוא המהירות. זה elution כפול מבטיח כי כמות מקסימלית של Crna הוא התאושש הממברנה.
11. העברה זו קרנה נקי ביוטין, שכותרתו צינור חדש מ"ל ו 1.7 צנטריפוגות התווית כראוי.
12. קבע את ריכוז Crna באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל במהלך ההליך בידוד RNA. הקלט את הריכוז 260/280 יחס.

8. פיצול Crna להכנת יעד

1. לייבל 0.5 מ"ל צינור PCR עם פרטי זיהוי שלך. העברת 5 UG סכום שווה ערך של Crna אל הצינור. הוסף מספיק RNase ללא מים להביא את הנפח הכולל ל ul 16.0, ולאחר מכן להוסיף 4.0 μl של חיץ הפיצול 5X אל הצינור. ההיקף הכולל של הצינור צריך להיות 20.0 ul.
2. וורטקס את הצינור צנטריפוגות למשך 10 שניות. דגירה הצינור ב 94 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב thermocycler. שימי על הקרח הבאה הדגירה.

9. הערכת Crna מקוטעת Unfragmented באמצעות agarose ג'ל

1. הגדרת מנגנון E-ג'ל אלקטרופורזה באמצעות ג'ל 1.2% precast agarose. טרום להפעיל את הג'ל למשך 2 דקות על פי המלצה של ייצור
2. הוסף 14 μl של מים גם על כל ג'ל-E.
3. הוסף 2μl המדגם שכל טוב לכל pipet מעלה ומטה כדי ומערבבים היטב. נתח הן את קרנה מקוטעת unfragmented של כל דגימה. מומלץ לטעון את דגימות (מקוטעת unfragmented) במסלולים סמוכים. הקלט את זהותו של כל דגימה בנתיב אחד.
4. הוספת 4 μl של סולם ה-DNA (סולם ביוליין קל אני בגודל סטנדרטי או Novagen סמן PCR) לנתיב אחד הג'ל
5. הפעל את הג'ל למשך 20 דקות.
6. דמיינו את E-ג'ל על transilluminator. קח תמונה ג'ל.

10. הכלאה של שמרים 2.0 GeneChip

נציג תוצאות:

באיור 1. סרוקים Affymetrix שמרים GeneChip תמונה (Affymetrix תוכנה GeneChip הפעלה (GCOS))

Figure2. פיזור העלילה 2D של כל תמלילי גנטי (~ 6700 גנים), השוואת נתונים מלאה שמרים טיפול. כל נקודה מייצגת גן יחיד. גנים בצבע סגול עולה הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בעוד גנים בצבע אדום לא. תיאורי עבור הגנים הביע דיפרנציאלי מכונים במקרא המתאים ביותר הם המעורבים בבקרת מחזור התא בדוגמה זו. (Affymetrix GeneChip הפעלה תוכנה (GCOS))

באיור 3. תרשים זרימה זה ממחיש באופן דיפרנציאלי גנים הביע במסלול הביולוגי מושפע. הגנים המצוין עם כוכב אדום לציין את למטה מוסדר הגנים במסלול meiotic. (מסד נתונים עבור ביאור, ויזואליזציה משולב דיסקברי (דוד)

באיור 4. תוצאות נציג מגרש הר געש. דגימות בקרה מטופלים הושוו עם ערך p מנותקים של 0.05 ושינוי הביטוי 1.5 לקפל מנותקים. העלילה הזה נוצר באמצעות תוכנה Genesifter של Geospiza תרם בעין יפה את התלמידים למטרות חינוכיות.

CDNA תערובת	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

Discussion

יישומים משמעות.

גנטיקה ורמונט תוכנית רשת Outreach, באוניברסיטת ורמונט, עורכת ראשון הושטת לשמונה מכללות בגרות שותף ברחבי המדינה. המטרה של VGN Outreach Core היא לחשוף סטודנטים במדינת ורמונט הטכנולוגיה המדינה-of-the-art & משאבים מדעיים באמצעות הידיים על חוויות. המודול microarray תיאר פותחה בשנת 2003 שודרג לאחר מכן. זה כבר הציע כמנה מיני או להשתלב בתכנית הלימודים במעבדה קיימת בכל המוסדות המשתתפים.

פרויקט זה, בין האוניברסיטה ליבות מחקר לתואר ראשון במכללות, מקדמת שיתופי פעולה בתחום החינוך והמחקר. Microarray הושטת ברחבי המדינה שיפרה הלימודים ויצרה מחקר הזדמנויות הרשתות עבור מתקני הגרעין, סגל וסטודנטים.

כפי לתואר ראשון בפקולטה לאמץ את התוכנית הם עודדו עיצוב ייחודי ניסויים בתנאי שלא מתאימים GeneChips Affymetrix ו ביאור זמין. כל המידע עבור מודול זה כולל במדריך מעבדה, הפניות מצגות PowerPoint זמינים באופן מקוון (ורמונט גנטיקה רשת, 2008).

צעדים קריטיים:

Spheroplasting: חשוב לשמור spheroplasting מוצלח מתחת למיקרוסקופ. השימוש SDS הוא מאוד מועיל כפי שהוא גורם לנפיחות שמרים וכתוצאה מכך spheroids. חשוב לשים לב, כי התאים ניצני טופס spheroids גם כן. אם spheroplasting חלקי הוא ציין, טיפול ממושך עם lyticase מומלץ.

גלולה ניקוי: במהלך התגובה המשקעים צעד הבאים כביסה אתנול, קל מאוד לאבד את גלולה cDNA. בזהירות רבה ותשומת לב קפדנית על גלולה הכרחי.

יישום מים למרכז הממברנה: במהלך הצעד elution RNA מן הקרום, חשוב "להשפריץ" 30 μl מים ישירות למרכז של קרום סיליקה. אם זה לא נעשה, בעמודה ניתן centrifuged ואת elutant וכתוצאה מכך ניתן להחיל מחדש את קרום סיליקה שוב. זה יכול להיות חזר פעמים רבות ככל הדרוש.

שינויים ותחליפים המוצר:

1. אלטרנטיבי RNA לנקות העמודות ניתן להחליף. דוגמאות לכך הן ה-USB-הכנה בקלות הטהורה Invitrogen קישור RNA הערכה, ואת הרנ"א אומגה לנקות הערכה עד כמה שם.
2. Pombe Schizosaccharomyces הוא שמרים אופציונלי. GeneChip Affymetrix מכיל גם הגנום על אותו שבב
3. טיפולים שונים פעמים ניתן להשתמש. זה עשוי לכלול טיפולים תרופתיים, טיפולים טמפרטורה, נוגדי חמצון וכו 'פעמים הטיפול עשוי גם להיות מותאם.
4. טיפול DNase לא ייתכן שיהיה צורך כי בשיטות המתוארות להעסיק את השימוש פריימר אוליגו (DT).
5. זה לא נדרש לבצע elution כפול של RNA את הטור עם aliquot 30 μl אותו. פעם הוא כמעט תמיד מספיק. זה הציע להבטיח התאוששות מלאה מתקבל. בנוסף, המים המשמשים elute רנ"א מהעמודה ניתן מראש מחומם ל 65 ° C כדי לשפר עוד יותר את היכולת לשחזר RNA מהעמודה סיליקה.
6. שיטות רבות זמינות לכמת RNA. Eppendorf ו Nanodrop רק נבחרו קלות השימוש שלהם ונבדק דיוק.
7. ג'ל אלקטרופורזה agarose רבים להתבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. E-Gel אינו נדרש אך רצוי כי זה RNase חינם ואינו דורש מיצוק ג'ל זמן ההמתנה.
8. מידע עבור סידור המוצרים סופקה. עם זאת, ריאגנטים בכלל רבים ניתן להזמין מיצרנים מרובים.
9. אחת ריאגנטים מחזור cDNA ניתן לרכוש בנפרד, אם כי הוא יותר חסכוני.
10. ישנם שני שיטות הכנה היעד אבל אנחנו מרגישים זו מציעה הזדמנויות ללמד יותר עבור התלמיד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocyler
Microcentrifuge
וורטקס
מערבבים צלחות (2)
P-10s pipettors
P-20 של pipettors:
Pipettors P-200 של:
P-1000 של pipettors:
מצלמה transilluminator
E-Gel Apparatus Invitrogen G6000-08
E-ג'ל Invitrogen G6018-02
Axygen 1.7 מ"ל. ברור Krackler 383-MCT175C
Axygen 0.5 צינורות מ"ל ברור Krackler 383-MCT060C
Axygen 2ml ללכוד צינורות Krackler 383-MCT200NC
תיבות של P-10 טיפים לאמנות: CLP BT10XL
תיבות של P-100 טיפים לאמנות: CLP BT200
תיבות של P-20 טיפים לאמנות: CLP BT20
תיבות של P-1000 טיפים לאמנות: CLP BT1000
שמרים Chips
25 מ"ל pipets-חד פעמי סטרילי
Pipets-5 מ"ל חד פעמי סטרילי
Microfuge מתלים צינור
KimWipes:
מעבדה מעילים
מערבבים ברים
תרבות צלוחיות
לולאות Innoculating
Sharpies
כפפות
החיטוי קלטת
Stirrer ברים
30% מימן פראוקסיד EMD Millipore 386790
HBSS ללא Ca, Mg, או צבע סיגמא אולדריץ H6648-100 מ"ל
Qiagen Rneasy מיני קיט: Qiagen 74104
Qiagen DNase קיט: Qiagen 79254
Rnase Remover Denville מדעי D1180
Harleco אלכוהול 100% EMD Millipore 65347
אנצו IVT Kit אנזו ENZ-42655-10
Lyticase: בקבוק אחד VWR IC19012310
שמרים התרבות: ATCC 18824
YPD אבקת מרק EMD Millipore 4.8504
D (+) גלוקוז, נטול מים EMD Millipore 346351
סורביטול EMD Millipore 56755
EDTA EMD Millipore 4005
SDS פתרון, 20% EMD Millipore 7990-OP
גלולה Paint EMD Millipore 69049
PCI RNase DNase חינם (7 aliquots): פישר AC32711-500
7.5 NH4OAc פישר ICN1987 5980
פיצול חוצץ (200 מ"מ טריס-Acetate, pH 8.1, 500 מ"מ KOAc, 150 מ"מ MgOA)
Trizma Base Fiaher 50-899-90034
KOAc פישר NC9757725
MgOA פישר NC9681042
Loading Dye Invitrogen 10482055
PCR סמנים EMD Millipore 69278-3
שלב הנעילה ג'ל פישר FP2302820
אחת מחזור cDNA Kit Invitrogen A10752-030
כולל;
א coli DNA Pol
של dNTP
T4 DNA Pol.
T-7 oligod (T)
EDTA 0.5ml pH 8.0
סטרנד ראשון הצפת
א קולי RNaseH
סטרנד השנייה הצפת
א האנזים דנ"א קולי
עילי II
DTT