הערכת מתחפרת, בניית קן, ו אגירה של עכברים

Summary

מתחפרת, קינון אגירה הם מינים טיפוסי פעילויות עכברים בקלות לבצע במעבדה. מאמר זה מתאר כיצד הם יכולים להעריך בקלות ובזול. פרוטוקולים אלה רגישים במיוחד זן העכבר, נגעים במוח ומחלות. יתר על כן הם מהווים "העשרה סביבתית" לעכברים, ואת לגלם את "חידוד" היבט של "3 Rs" 18.

Abstract

הידרדרות ביכולת לבצע "פעולות יומיומיות" (ADL) הוא סימן מוקדם של מחלת אלצהיימר (AD). ההקרנה של טיפולים התנהגותיים Preclinical אפשרי לספירה כיום מתמקד בעיקר בדיקות קוגניטיביות, אשר לעתים קרובות דורש ציוד יקר והרבה זמן הניסוי. עם זאת, זיכרון אפיזודי האדם (ההיבט מושפעת באופן חמור ביותר של הזיכרון לספירה) שונה לזיכרון מכרסם, אשר נראה כי במידה רבה לא אפיזודי. לכן הדרכים הנוכחי של סינון עבור טיפולים לספירה חדשה לספירה במכרסמים סביר מהותית להצליח. גישה חדשה ההקרנה פרה יהיה לאפיין את הליגה נגד השמצה של עכברים. למזלו, כגון מספר מבחני לאחרונה פותחה באוניברסיטת אוקספורד, והנה שלוש הרגישים ביותר היטב מאופיין מוצגים.

נבירה פותחה לראשונה באוקספורד ^13. היא התפתחה מתוך צורך לפתח פרדיגמה אגירה העכבר. רוב לפרסםאגירה ed פרדיגמות מכרסם נדרש מקור מזון מרוחק להיות מקושרים הכלוב הביתה בקטע המחבר. זה יהיה כרוך שינוי בכלוב הביתה, כמו גם ביצוע עכבר הוכחה מעבר חיבור מקור מזון. אז זה היה נחשב אם אפשר יהיה לשים את מקור המזון בתוך הכלוב. נמצא כי אם המכולה הוצבה על הרצפה זה היה מרוקן עד הבוקר הבא., כדורי המזון, לעומת זאת, פשוט שהופקדו בערימה בפתח המכולה, ולא להציב במקום בדידה מן המיכל, כפי שניתן היה לצפות אם העכברים היו באמת לאגור אותם. מבט מקרוב הראה כי העכברים היו ביצוע חפירה ("נבירה"), תנועות, לא נושאת את כדורי בפיהם למקום שנבחר כפי שהם היו אם באמת לאגור אותם. ⁶

כופתיות מזון אינם מצע חיוני מתחפרת, עכברים שפופרות הריק יהיה מלא חול וחצץ, אפילו מצעים מלוכלכים מהכלוב שלהם. יותרושוב, הם יהיו ריקים צינור מלא גם אם ריקה מונחת לידו ^8.

קיימים מספר פרוטוקולים קינון בספרות. אוקספורד להציג את אחד מפשטת את ההליך יש מערכת מוגדרת היטב ניקוד על איכות הקן ^5.

הפרדיגמה אגירה פותחה מאוחר יותר שבו עכברים, ולא אגירה בחזרה לכלוב בית אמיתי, הותאמו החיים "בסיס הבית" של מנגנון אגירה. בסיס זה הבית היה מחובר צינור עשוי רשת תיל, סוף דיסטלי של שהכיל את מקור המזון. הסדר זה הוכיח התנהגות אגירה תשואה טובה, כל עוד עכברים הותאמו החיים "בסיס הבית" במהלך היום מותר רק כדי להזין את הצינור אגירה בלילה.

Protocol

1. נבירה

1. מנגנון

מיכל עיצובים שונים נשפטו (למשל כד מתכת שאפשר לנקות בקלות, אבל עכברים לא ששו להיכנס אליה). בסופו של דבר התגלה כי אורך של downpipe פלסטיק (מחובר כדי המרזב על בתים) מוגבה מעט בקצה אחד כדי למנוע תזוזה מקרית (לא מכוונת) של כדורי מזון אטום בקצה השני, היה קטע של מנגנון יעיל. בורוז נעשים כעת מ downpipe פלסטיק, בקוטר 68 מ"מ, וחותכים באורכים 20 ס"מ (איור 1). קצה אחד הוא חתום עם תקע של 12 מ"מ צפיפות fibreboard בינונית (MDF). (הגנה על הנשימה מומלץ כשעובדים עם mdf). לצורכי ניקוי ו - איטום, מתחם עמיד למים דבק מסטיק יכול להיות מיושם על המשטחים ומחוצה mdf וכן מנה להדביק אותו לתוך הצינור מתחפרת. ברגים Machine (5 ס"מ) משמשים כדי להעלות את סוף o אחריםו 3 ס"מ צינור מהרצפה. שני חורים הם קדחו 1 ס"מ מהקצה הפתוח של הצינור נבירה בזווית של 90 ° הברגים מוכנס והידקו ^4.

הקוטר של מחילות הוא כנראה קריטי; שמיד-הולמס ואח' ¹⁹ הבחינו כי העכברים בטבע "המאורה ניקה" בעיקר מחילות דומים בגודלם לאלה מלאכותי שלנו..

באיור 1. עכבר בצינור מתחפרת.

2. נוהל

1. התרגלות
   התחפרות היא ספונטנית בדרך כלל, אבל יש אלמנט למידה מסוימים. תהליך למידה מוגברת על ידי סיוע חברתי. לכן במקום להתחפר מלא לילה לכלוב קבוצת הבית של עכברים אשר מאוחר יותר כדי להיבדק עם טיפול. מאורה כל מתמלא 200 גרם של כדורי ומזון המסופקים בדרך כלל כמו דיאטה. (הכוונה לאהוא סוג דחוס צפופה של דיאטה, אם דיאטה "מורחבת" הוא בשימוש מאורה יחזיק פחות מ 200 גרם). הניסויים צריך לקחת בחשבון גורמים כגון בעת ​​בחירת המצע מתחפרת.
   
   אם עכברים הם על קיצוב מזון (למשל, על מנת להניעם לפעול משימה מבוך בו זמנית למידה) מזון ללא חומרים ניתן להשתמש, עבור כדורי חימר, למשל, משמש לקו פני הקרקע בעציצים צמח מקורה; אפונה רעפים (אבנים קטנות ~ 1 ס"מ קוטר) וחול. רעפים חול אפונה, להיות שלוש פעמים כבד יותר כופתיות מזון, הם תחליפים שימושי כופתיות מזון עכברים אם הם מתחפרים מאוד נמרצת, כדי למנוע "אפקט התקרה".
2. Baselining
   הפעלה (רצוי שתיים) הבסיס נבירה בדיקות 48 שעות זו מזו באותה דרך כמו ייעשה לצורך בדיקות לאחר הטיפול המוצע. המבחן הוא התחיל בצורה אופטימלית בסביבות השעה 4 אם עכברים הם שוכנו על מחזור 0700-1900 כהה אור ש. זהו זמן רגישכדי לבדוק, כפי שהם בדרך כלל לא ער בשעה זו נבירה מתחיל לאט יותר מאשר אם הם היו היטב לשלב כהה, וכתוצאה מכך מאוד פעילה. שעתיים לאחר תחילת, מדידה "צילום" נלקח המשקל של המזון התחפר; מאורה היא רוקנה לתוך מיכל טיט ומשקלו וכדוריות החליפו לתוך המאורה שבה הוא להחזיר לכלוב. אם העכבר נמצא במאורה, ממש בעדינות ויוצקים את תוכן לתוך המיכל במשקל ולהחליף את העכבר בתוך הכלוב. משקל התחפר בבית שעתיים לאחר מכן מחושב מהמקור 200 גרם על ידי חיסור הקריאה הסופית היא נלקחה למחרת בבוקר. תזמון אינו קריטי כמו עכברים תהיה חזרה לישון (לעתים קרובות המאורה) והם כבר לא פעיל מתחפרת. השתמש מדידה 2 שעות נלקח למשפט השני כדי ליצור קבוצות מאוזנות לביצוע המחקר. כמו נבירה עולה עם תרגול ^17, baselining גם עוזר העכברים להגיע asymp יציבה יותרביצועים totic אשר חושף השפעות הטיפול טוב יותר.
3. בדיקה
   למטרות בדיקה, לאחר טיפולים ניתנים עכברים מקבלים את המבחן מתחפרת בדיוק כמו בשלב baselining. אם הבדיקה מתחפרת היא לשמש באופן כרוני, מומלץ כי לפחות 48 שעות מבחנים נפרדים כדי למנוע ירידה בביצועים עקב חשיפה מעל הנוהל.
4. פתק
   אל תחליף המזון התחפר על הרצפה בכלוב לתוך המאורה. גם אם העכבר לא התחפר דבר, לבצע את ההליך במשקל כפי שהיית עושה אם נבירה התרחש; ההפרעה הנגרמת על ידי שקילה נוטה לעורר התנהגות, העכברים אשר התחפר כבר כמה המצע לעיתים קרובות להתחיל מתחפרת במרץ מחודש לאחר תהליך השקילה.

2. תוצאות צפויות

C57 ~ BL / 6 עכברים במאורה בדרך כלל סביב 70 גרם בשעתיים הראשונה, ליד 200 גרםבן לילה. עכברים lesioned בהיפוקמפוס לעתים קרובות המאורה פחות מ 5 גר ^'11 (איור 2). המחלה Prion מעכב נבירה ^1,2, כפי שעושה הממשל lipopolysaccharide ^20. נבירה יכול לזהות (scrapie) מחלת הפריון ב 10-12 שבועות לאחר ההזרקה של homogenate מוח חולה, ואילו הסימנים הקליניים מופיעים רק בגיל 22 שבועות ^13. (איור 3). נבירה הוכח להיות רגישים להבדלים זן ¹⁵ ו עקום החוצה של אשלגן ערוץ ¹⁰ יחידות משנה יון.

באיור 2. משקל של כדורי מזון (חציונים וטווחי interquartile) התחפר שעתיים על ידי שליטה בהיפוקמפוס-lesioned עכברים. האחרון התחפר משמעותית פחות שולט (P = 0.0001).

באיור 3. משקלמזון כדורי (אמצעי) נברו בן לילה על ידי שליטה scrapie עכברים נגועים. נבירה מגדילה (עם תרגול) בשתי הקבוצות מהשבוע 7-10 שלאחר הזריקה, אבל משבוע 12 ירידות נבירה בקבוצה scrapie ואת ההבדל בין הקבוצות הופך משמעותי מבחינה סטטיסטית (עולה על שתי טעויות תקן של הממוצע).

3. דיון

בדקנו נובר מינים אחרים של מכרסמים - חולדות, גרבילים, אוגרים ועכברים קוצני המצרי ^8. אבל כל זה האחרון יכול להיגרם כמויות מאורה ניכר מצעים יבשתי כמו חצץ או חול, אבל נבירה של כדורי מזון היה הרבה פחות, גם לאחר ניסיון רב עם חומרי כדור הארץ. הסיבה להבדל זה מעכברים אינו ידוע. אחרי העבודה הזאת נעשה, התגלה כי עכברים קוצני המצרי לא למעשה לעשות מחילות בטבע, הם יכולים לכבוש מחילות שנעשו על ידי גרבילים, גם את פני השטח של חה הטבעי שלהםbitat לעיתים רוק כבד. תצפית אחרונים בניירובי הראו כי, בתוך Acomys הסוג, קוצני של וילסון העכבר (Acomys wilsoni) ו קוצני פרסיבל של העכבר (Acomys percivali), אשר עושה במאורה בטבע, התחפר גם במעבדה.

4. קינון

1. מנגנון

בדיקה זו מבוצעת בכלובים בודדים, אלה אותם לשמש עבור נבירה מתאימים. מצעים רגיל אמור לכסות את הרצפה לעומק של 0.5 ס"מ. (וריאציה לעומק, מצעים עמוק מאוד, יכול להשפיע על בניית הקן). כל כלוב מסופק עם "Nestlet", ריבוע 5 ס"מ של יריעות כותנה מגוהצים (Ancare).

2. נוהל

עכברים ממוקמים בנפרד לפני שלב בחושך לתוך כלובי קינון כשעה, והתוצאות מוערכים למחרת בבוקר. כמו נבירה, ומסיבות דומות, תזמון אינו קריטי.

3.מניה

הקנים מוערכים בהיקף של 5 נקודות (איורים 4-8), ואת כמות untorn Nestlet נשקלת גם ^5.

1. Nestlet היא נגעה בעיקר (> 90% ללא שינוי).
2. Nestlet נקרע חלקית עד (50-90% הנותרים ללא פגע).
3. Nestlet הוא מגורר בעיקר אך לעתים קרובות אין אתר קן זיהוי: <50% Nestlet נותר ללא פגע אבל <90% בתוך רבע שטח רצפת הכלוב, כלומר כותנה לא נאסף לתוך קן אבל להתפשט סביב הכלוב . הערה: החומר עשוי לעיתים להיות באזור קן בהגדרה רחבה אבל ההגדרה היא קריטית כי 50-90% כבר מגורר.
4. קן לזיהוי, אבל שטוח:> 90% Nestlet שסוע, החומר נאסף לתוך קן בתוך רבע שטח של רצפת הכלוב, אבל בקן שטוחה, עם קירות גבוהים יותר מאשר גובה גוף העכבר (מכורבל על הצד שלה) על פחות מ -50% של היקפו.
5. N (ליד) מושלםest:> 90% Nestlet שסוע, הקן הוא מכתש, עם קירות גבוהים יותר מאשר גובה העכבר על הגוף יותר מ -50% של היקפו.

איפה הקריטריונים אינם מסכימים לפצל את ההבדל. לדוגמה קן מושלם עם חתיכת 0.7g unshredded היה הציון 4.5.

איור 4. קן ציון 1

איור 5. קן ציון 2

איור 6. קן ציון 3

איור 7. קן ציון 4

איור 8. Scor קןה 5

4. תוצאות צפויות

שני זכרים ונקבות לעשות קינים, כמו מטרתם היא thermoregulation כמו גם להיות קשורה ברבייה. עבור עכברים C57BL / 6, עשרות קן זכרים ונקבות הם באותו טווח, אם כי לא עשינו השוואה מבוקרת בניסוי יחיד. רוב העכברים C57BL / 6 ציון 4-5 על בניית הקן, אך כאשר ההיפוקמפוס הוא lesioned את הציון הממוצע יהיה סביב 1-2, ציון של 3 סביר להיות חריגה (איור 9). קינון גם הוכיח שהוא רגיש למחלות הפריון סביב 10-12 שבועות ^1,2,16.

איור 9. ציוני קן (חציונים וטווחי interquartile) עבור העכברים מלאה בעכברים עם נגעים של ההיפוקמפוס, הגב הגחון ומלא. רק עכברים lesioned להשלים להראות עיכוב של קינון, כך ההשפעות של הגב סלקטיבית ventrאל אזורים מופיעים משנה סף אבל כתוסף.

5. אגירה

1. מנגנון

סדרה של "בסיסים הביתה" מחוברים צינורות עשוי רשת תיל, חתומה לצמיתות בסוף דיסטלי שם כדורי מזון ממוקמים באופן זמני בסוף הפרוקסימלי של תקע עץ. זה משמש כדי למנוע את העכברים נכנסים צינורות לפני הסתגלות לבסיס הבית יש occurred7.

המכשיר (איור 10) יכול להתבצע בדרכים שונות, כל עוד העקרונות הבסיסיים הם דבקו. שלנו מורכב משורה של 8 קופסאות עץ, כל אחד 30 x 13 x 15 ס"מ עם מכסי פרספקס שקוף. כל מסופק עם בקבוק מים, יש חור בגב שאליו צינור אגירה הוא שכיבות מצויד. צינורות עשויים פלסטיק שחורים, 10 ס"מ, קוטר 40 מ"מ, הצטרפו אל צינור התיל, 45 ס"מ, קוטר 4 ס"מ, כדי ליצור האורך הכולל של 50 ס"מ. רשת מורכבת של 13 ריבועים מ"מ,והוא גליל כפול עם meshes אי - מיושר לעשות את החורים רשת קטן ולמנוע נשירה באמצעות כדורי מזון. אם רשת הריבוע 6 מ"מ זמין זה הוא חומר טוב בתור אחד לגלגל יהיה מספיק. סוף דיסטלי של הצינור, שם כדורי מזון ממוקמות, סגור. סוף הפרוקסימלי אטום עם פקק עץ נשלפים.

איור 10. עכברים בתוך הצינורות אגירה

2. נוהל

1. בדרך כלל, אגירה הוא משתנה מאוד בפעם הראשונה ועכברים מסוימים לא מטמון בכלל. אגירה, כמו נבירה, משתפרת עם התרגול. לכן, כאשר תכנון הניסוי מאפשר, הפעלות baselining מקבלים הטובה ביותר לפני טיפול מנוהל. ברור, זה לא מעשי אם המשתנה הבלתי תלוי הוא מולד, כמו עם עכבר (לא מותנה) מוטציה או כאשר בדיקת זנים שונים העכבר.
2. עכבר מוכנס לתוךכל תיבת בתחילת היום כדי להרגיל אליו. הקופסה מסופקת עם מנהרה קרטון אשר כבר בתוך כלוב קבוצה אמיתית הביתה ללילה אחד לפחות, גם מנה נדיבה של מצעים מלוכלכים, כדי לעשות את זה מרגיש כמו "הביתה". גישה הצינור אגירה נמנע עד הערב עם פקק עץ. 100 גרם מזון כופתיות (תערובת של קטנים וגדולים) ממוקם בקצה הדיסטלי של הצינור אגירה (על ידי שפיכת אותם בקצה השני עם צינור המוחזק במאונך). כדי לוודא העכבר רעב קלה לפני הבדיקה מתחילה, תיבת הביתה לא מסופק עם מזון.
3. ממש לפני תחילת השלב בחושך, להסיר את פקק עץ כדי לאפשר גישה העכבר הצינור אגירה. למחרת בבוקר (שוב, העיתוי אינו קריטי) לאסוף לשקול את כל כדורי מזון אשר נאגרו לתוך תיבת בסיס הבית.

6. תוצאות צפויות

שימוש C57BL נקבה / 6 עכברים, והסכום הממוצע אגר יהיה סביב50-70 גרם נגעים בהיפוקמפוס מאוד לדכא hoarding11, ואילו נגעים קליפת המוח הקדם חזיתית יש רק השפעה חלשה ¹² (איור 11).

איור 11. משקל של כדורי המזון על ידי אגר מלאה המדיאלי הפריפרונטלי קליפת המוח, בעכברים lesioned (חציונים וטווחי interquartile). למרות חציונים שונים במידה ניכרת, שונות גבוהה שולט על אמצעי התוצאה רחוקה מלהיות מובהק סטטיסטית (p = 0.3).

Discussion

בדיקות אלו הינן פשוטות ביותר להפעלה אך בגדלים השפעה הן גדולות מאוד, מה שהופך אותם רגישים במיוחד לטיפולים, הבדלים זן, וכו 'הם תואמים את ההיבט "חידוד" של ראסל Burch של 3 Rs ^"18. ואכן, ביצועים טובים במבחנים כמו נבירה כנראה מעיד על בריאות כללית טובה אצל בעלי חיים. לכן זה יכול להיות מבחן טוב עבור הערכה של רווחת בעלי חיים.

החשיבות של העשרה סביבתית מכרסמים במעבדה מוכרת היטב בימים אלה. מתן חומר קינון כיום מקובל בבתים בעלי חיים רבים, ואת זה קל לעשות. ההתלהבות שבה מאורה עכברים עושה נבירה העשרה מצוין בפוטנציה, אך למרבה הצער "עצמית מחדש" המאורה שבה תהיה אפשרות מעשית לספק זה טרם פותחו. אם העכברים למצוא אגירה להעשיר טרם נקבע.

_content "> חסרון אחד הוא כי הנתונים שנוצר על ידי בדיקות אלה היא בדרך כלל אי ​​- פרמטרית (לא גאוס בחלוקת), המתאימה כל כך אי - פרמטרית סטטיסטיקה יש צורך לנתח אותם, למשל את מבחן Mann-Whitney U להשוואות pairwise, Kruskal- ואליס ANOVA עבור הקבוצה מרובת נתונים. אם חזר עיצובים אמצעים המשמשים, שכן אין מבחן ANOVA מתאים שאינם פרמטרית הנתונים, התוצאות ניתן להפוך, למשל על ידי שורש ריבועי או נהלים להתחבר כדי לגרום להם לציית הפצה נורמלית יותר .

המדידות של המנגנון יכול להיות שונה במקצת לאלה שצוינו בטקסט (שימושי עבור הנסיינים ארה"ב) אבל ההבדלים רחב יש להימנע. עם זאת, במקרים מסוימים נסיינים אחרים עשויים למצוא מבנים שונים לעבוד טוב יותר מאלו שתוארו כאן.

באשר כל המדידות התנהגותיות, העכברים צריך להיבדק כדי לראות אם רמת הפעילות שלהם הן נורמליות, כמו חוסר פעילות יהיה ברור יש detrimאפקט ental על מינים טיפוסי התנהגויות. כאשר scrapie הנגועים בעכברים הראו נבירה לקויי קינון, רמות הפעילות שלהם היו תקינות (נבדק המנגנון שדה פתוח). אכן, תקופה של היפראקטיביות מתרחשת סביב 2-4 שבועות לאחר מינים אלה טיפוסי נפגעות התנהגויות הראשון ^2.

ליקוי חזק המיוצר על ידי נגעים בהיפוקמפוס על מתחפרת, קינון אגירה, כל אלה הם מינים טיפוסי התנהגויות, משלים את ליקויי למידה מרחבית memory9 שהם כאלה ומבוססת ההשפעות של נגעים אלה. הם נראים שווה את ליקויי בפעילויות היומיומיות האופיינית כל כך ¹⁴ לספירה.

אלו זנים טיפוסי בדיקות עשוי להתברר שימוש רב ההקרנה פרה טיפולים למחלת אלצהיימר ומחלות ניווניות אחרות ^14. ברבות הפרעות המוח האנושי יכולת אובדן או מופחת לבצע ערב רגילמשימות ryday חשובה כמו תכונות אחרות של המחלה כמו ליקוי קוגניטיבי. במיוחד, הפסד זה עשוי להצריך מעורבותו של המטפלים ואת נטל כלכלי גדול כל כך קרובות זו מטילה.