נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Summary

פרוטוקול מהירה לצורך זיהוי ישיר של אנטרוקוקוס faecalis ומינים אחרים אנטרוקוקוס מתרבות דם חיובית באמצעות חומצות גרעין פפטיד ניאון assay הכלאה באתרו (FISH PNA).

Abstract

Enterococci הם גורם שכיח של בקטרמיה עם E. faecalis להיות המין השולט ואחריו E. פאציום. בגלל התנגדות אמפיצילין ו vancomycin ב E. faecalis עדיין בהשוואה נדיר ההתנגדות E. פאציום, פיתוח של בדיקות מהיר המאפשר הבחנה בין מינים enterococcal חשוב עבור טיפול מתאים ומעקב התנגדות. E. faecalis OE assay PNA דגים (AdvanDx, Woburn, MA) משתמשת מינים ספציפיים גרעין פפטיד חומצה (PNA) בדיקות הקרינה ב בפורמט הכלאה באתרו ומציע זמן התוצאות של 1.5 שעות פוטנציאל לספק מידע חשוב עבור מינים ספציפיים הטיפול. מחקרים Multicenter בוצעו כדי להעריך את הביצועים של ה 1.5 שעות faecalis / OE הליך PNA FISH לעומת הליך assay המקורי 2.5 שעה לשיטות בקטריולוגיה תקן לזיהוי enterococci ישירות מתוך בקבוק דם חיובית לתרבות.

Protocol

1. הדגימה איסוף הכנה

1. איסוף דם ורידי מחולים החשודים אלח דם ולשים לשתי BACTEC (BD, ניצוצות, MD) בתרבות בקבוקי דם, אחד ואחד אנאירובי אירובי, יחד תרבות אחת הכוללת מערכת הדם.
2. המקום בקבוקים לתוך המכשיר 9240 BACTEC ב 35 ° C.
3. לדגור עד מכשיר האזעקה מופעלת לתוך בשל הצמיחה של אורגניזמים בבקבוק תרבות דם.
4. הסר בקבוק מהמכשיר תרבות דם.

2. הכנה של ריאגנטים לפני מכתים

1. הכן את פתרון לרחוץ על ידי הוספת 4 מ"ל של פתרון לשטוף 60x ואחריו 240 מ"ל מים מזוקקים או deionized טריים ישירות המנה מכתים.
2. שים את צלחת מכתים את האמבטיה C ° 55 מים חמים.
3. חנות להתרכז הנותרים בבית 2-8 ° C.
4. הסר את הרכבה בינונית מהמקרר ולחמם לטמפרטורת החדר.

3. גראם מכתים

1. מערבולת בעדינות את הבקבוק תרבות דם.
2. באמצעות מחט מזרק או מנגנון subculturing, להסיר דם (כ 5 מ"ל) מהבקבוק ומכניסים צינורית בורג סטרילי כתרים.
3. בעזרת פיפטה סטרילית, במקום טיפה אחת גדולה של דם לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
4. האוויר יבש השקופית ולתקן ב מתנול למשך 10 שניות.
5. אפשר להחליק לייבוש באוויר.
6. בצע גראם כתם על הסרט דם כדי לקבוע את המורפולוגיה של האורגניזם גדל בבקבוק תרבות דם.
7. שימוש העדשה טבילה שמן, להציג שקופיות. Cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות קצר נצפה על הכתם גראם עולה בקנה אחד עם רוב המינים אנטרוקוקוס.
8. זו תוצאה כתם גראם אז כוננים הבחירה של ערכת בדיקה נאותה PNA FISH להשתמש לצורך זיהוי חיידקים. תרבות זו תהיה מוכתמת בדם באמצעות E. faecalis / OE FISH PNA הכתם.

4. FISH PNA כתמים

1. מערבבים את שפופרת המכילה את הדם בעדינות על ידי מתערבל לפני הכנה למרוח.
2. מניחים טיפה אחת של פתרון קיבעון היטב של שקופיות מיקרוסקופ FISH PNA.
3. העברת 10 μL או טיפה אחת קטנה מהצינור עם התרבות דם חיובית הפתרון קיבוע ומערבבים בעדינות emulsify.
4. תקן את הכתמים על ידי חימום אותם 20 דקות. בשעה 55 ° C על צלחת החימום.

5. בקרת איכות חומר

אחת חיובית ואחת שלילית שקופיות בקרת איכות חייבים להיבדק עם כל אצווה של שקופיות עבור מכתים.

1. השתמש E. faecalis / OE בקרה שקופיות שנרכשו AdvanDx למטרה זו או להכין מריחות מתרבויות נוזלי של זנים התייחסות של E. faecalis וא פאציום כמו בקרה חיובית או בשקופיות נפרדות או מעורבות בשקופית אחת Staphylococcus spp או סטרפטוקוקוס spp כחומר בקרה שלילית.

תוצאות QC צריכים להיות מסוגלים לפקח על התנאים הבדיקות המתאימות, במיוחד אלו המשפיעים על חומרא הכלאה קיר חדירה לתא, מאז מתודולוגיה הרשות הפלסטינית נועד לייעל את הקיר חדירה לתא

6. הכלאה

1. הוסף טיפה אחת של E. faecalis / OE PNA לבאר בשקופית מיקרוסקופ עם הכתם.
2. הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר.
3. דגירה של 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C בצלחת חימום
4. בעקבות מקום דגירה השקופיות במנשא שקופית

7. מחמירים שטפי

1. הספק שקופיות לטבול הפתרון לשטוף שחומם מראש ב 55 ° C ו בזהירות להסיר את coverslip. לעתים קרובות, coverslip השקופיות את ידי בעדינות להסעיר את השקופית בפתרון לשטוף. מדי פעם, coverslip יש דחף בעדינות את עם מלקחיים.
2. דגירה בפתרון לשטוף במשך 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C.
3. הסר את השקופיות מפתרון לשטוף
4. אפשר להחליק לייבוש באוויר

8. הרכבה

1. הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית עד שקופית
2. הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר.
3. בדוק את השקופית מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך 2 שעות.
4. אל תחשוף את השקפים לכוון אור השמש או אחר מקורות אור חזק כמו זה עלול להוביל מרווה פלואורסצנציה.

9. פרשנות של תוצאות

מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש לבדיקה שקופיות חייב להיות מצויד במסנן בנד AdvanDx כפולה מטרה או שמן 60x 100x. השקופיות QC יש לבחון תחילה לאשר הכלאה כי עלה. E. faecalis אמור להופיע כפי בהיר cocci פלואורסצנטי ירוק בתחומים מרובים של נוף ואת פאציום E. יופיעו אדום בוהק cocci. Non-enterococci שקופית מלאה אמור להופיע nonfluorescent. לאחר אישור המערכת שולטת, מגלשות החולה יכול להיבדק. בתחילה דם filמ 'יופיעו אדמדם אבל אדום בהיר וירוק cocci יהיה ברור למדי.

באיור 1. נציג דוגמאות של ירוק חיובי E. faecalis (משמאל), אדום חיובי E. פאציום (באמצע), ושלילי (מימין) תוצאות הבדיקה.

10. נציג תוצאות

שלושה מוסדות נכללו במחקר רב מרכזי קליני להערכת זה דג PNA כתם ומשווה פרוטוקול 2.5 שעה לפרוטוקול 1.5 מקוצר שעה שזה עתה הנסקרת. סך של 152 cocci שגרתי גראם חיובי בזוגות ורשתות (GPC) חיובי תרבות בקבוקי דם נכללו במחקרים. היה 100% (152/152) הסכם בין התוצאות של שינוי ושל הליך assay המקורי E. faecalis / OE FISH הרשות הפלסטינית: א '41/41 faecalis; enterococci אחרים 33/33 ו 78/78 GPC אחרים (טבלה 1). שיטה זו מכתים את רגישות וספציפיות מעולה במהלך המשפט הזה קליני (טבלה 2).

	שיטות שגרתיות	א faecalis / OE רגיל PNA FISH נוהל	א faecalis / OE PNA נוהל FISH קצר
א faecalis	41	41 (גרין חיובי)	41 (גרין חיובי)
א פאציום	27	27 (האדום חיובית)	27 (האדום חיובית)
א casseliflavus	2	2 (האדום חיובית)	2 (האדום חיובית)
א gallinarum	2	2 (האדום חיובית)	2 (האדום חיובית)
אחרים אנטרוקוקוס spp.	2	2 (האדום חיובית)	2 (האדום חיובית)
S. pneumoniae	17	17 (שלילי)	17 (שלילי)
ס viridans	33	33 (שלילי)	33 (שלילי)
ס mitis	1	1 (שלילי)	1 (שלילי)
S. pyogenes	3	3 (שלילי)	3 (שלילי)
ס בוביס	2	2 (שלילי)	2 (שלילי)
ס salivarius	1	1 (שלילי)	1 (שלילי)
ס sanguinis	2	2 (שלילי)	2 (שלילי)
ס agalagtae	7	7 (שלילי)	7 (שלילי)
אחרים סטרפטוקוקוס spp.	7	7 (שלילי)	7 (שלילי)
Abiotrophia spp.	3	3 (שלילי)	3 (שלילי)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (שלילי)	2 (שלילי)
סך הכל	152	152/152 100% הסכם	152/152 100% הסכם

טבלה 1. Listing של חיידקים נבדק הן באמצעות תקן (2.5hr) ומהיר (1.5 שעות) פרוטוקול.

רגישות E.faecalis	אחרים רגישות אנטרוקוקוס spp.	סגוליות
100% (41/41) 95% CI (93.0-100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100)	100% (78/78) 95% CI (96.2-100)

טבלה 2. רגישות וספציפיות של פרוטוקול PNA 1.5 שעה FISH.

Discussion

E. faecalis / OE assay PNA דגים אנטרוקוקוס יכול לספק זיהוי 2-3 ימים מוקדם יותר מאשר בשיטות תרבות סטנדרטי. הליך מקוצר עבור assay (1.5 כזאת?) מספק זיהוי מהיר שיכול לשמש עבור גישה טובה יותר לטיפול מיקרוביאלית והתוצאה המטופל. מחקר אחד כדי לתמוך זה בוצע על ידי פורסט, et al. (6). במשך שנתיים רצופות החל משנת 2005 את המעבדה למיקרוביולוגיה מזוהה cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות צומח בבקבוקי תרבות דם בשיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונאלי בשנת 2006 הוספת E. faecalis / OE PNA FISH. בנוסף אלגוריתם טיפול שפותחה על ידי צוות המוסדות מיקרוביאלית (AMT) להשתמש ביעילות את הנתונים שנוצר על ידי הרשות הפלסטינית FISH במעבדה באופן ובמועד. התוצאה העיקרית הייתה להעריך את הזמן מתרבות דם לצייר ליישום טיפול יעיל מיקרוביאלית לפני ואחרי FISH הרשות הפלסטינית הונהגה לתוך העבודה במעבדות. חומרת מיקום המחלה, החולה טיפול אמפירי מיקרוביאלית נמדדו. סך של 224 חולים עם בית החולים רכשה enterococcal בקטרמיה הוערכו עם 129 בתקופה טרום ההתערבות 95 בתקופה FISH PNA. FISH PNA מזוהה E. faecalis 3 ימים מוקדם יותר מאשר תרבויות קונבנציונאלי (1.1 לעומת 4.1 ימים, p <0.001). FISH PNA מזוהה E. פאציום חציון 2.3 ימים קודם לכן (1.1 לעומת 3.4 ימים, p <0.001) הייתה קשורה עם ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית הזמן ליזום טיפול יעיל (1.3 לעומת 3.1 ימים, p <0.001) וירידה 30 יום התמותה (26% לעומת 45%, p = 0.04). קבוצה זו הגיע למסקנה כי א faecalis / OE assay PNA דגים בשילוב עם אלגוריתם טיפול AMT הביא חניכה קודמות של טיפול אמפירי המתאים מיקרוביאלית עבור חולים עם בית החולים רכשה א 'בקטרמיה פאציום.

1. ריאגנטים אסור להשתמש אחרי תאריכי התפוגה מודפס על גבי התוויות ריאגנטים לא צריך להיות שונה בכל דרך שהיא. הם צריכים להישאר במקרר כאשר אינו בשימוש או שהם יכולים לאבד עוצמה.
2. תרבות בקבוקי דם צריך להיות מעורב לפני הדגימה.
3. חשוב לא לאפשר את קצה בקבוק טפטפת לגעת כתם דם כי זה עלול לגרום זיהום לחצות של חומר בין שקופיות, או לגרום לזיהום של מגיב.
4. ודא אמבט מים לחסום חימום מתוחזקים על 55 ° C. קבוע
5. אין להשתמש במסננים אחר מאשר מסנן או צבעים Dual Band לא יהיה להבחין בבירור.
6. אין להשתמש שקופיות מיקרוסקופ אחר מאשר שקופיות מיקרוסקופ או הכלאה לא תתרחש.
7. חשוב המיקרוסקופ פועל כהלכה. ודא את הנורה מיקרוסקופ בתוך מספר שעות של אושר לשימוש.

• נדירים המתרחשים מינים אחדים אנטרוקוקוס לא מזוהים על ידי בדיקה PNA והכלאה אנטרוקוקוס למינים אחרים, כגון E. asinii, E.dispar, א haemoperoxidus, א cecorum, א columbae, saccharolyticus א, א solitarius ו-E . גופריתי.
• Moraviensis E. מזוהה E. בשל הדמיון רצף faecalis.
• כמה זנים של Streptococcus anginosus לייצר פלואורסצנטי ירוק חיובי כוזב בשל הדמיון ברצף.
• תרבות VersaTREK בקבוקי דם לא הוערכו במהלך המחקרים הקליניים. המופע כדי לזהות E. faecalis ו אנטרוקוקוס אחרים spp. עם תרבות בקבוקי VersaTREK דם אינה ידועה.
• False autofluorescence ירוק חיובית עשויה להתרחש אם תקן FITC לסנן משמש במקום מסנן Dual Band.
• תוצאות שליליות שקר עשוי לעתים רחוקות להתרחש עקב צמיחה מעורבת או בשל טעות בטכניקה assay.
• סוג ומצבו של מכשור המשמש תשפיע על המראה החזותי של התמונה המתקבל. הקרינה עשויה varydue לסוג של מיקרוסקופ מועסקים, את מקור האור ואת רמת rRNA בתאים
• בידוד על התקשורת מוצק יש צורך להבדיל צמיחה מעורבת עם אורגניזמים אחרים כדי לזהות תרביות דם חיוביות מניב תוצאה שלילית.
• המוצר לא קיבל תוקף עם דגימות אחר מאשר תרבויות דם.

Materials