ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה קצירת של תאים בודדים מתרבויות עכברוש העיקרי העצבית וניתוח transcriptome הבאים באמצעות הגברה ארנה. גישה זו היא להכליל לכל סוג תא.

Abstract

ביטוי גנים רבים מסתמכים על טכניקות ניתוח חומר מבודד אוכלוסיות הטרוגנית של תאים או רקמות homogenates התאים בתרבית. ^1,2,3 במקרה של המוח, אזורים כמו ההיפוקמפוס מכילים הסדר מורכב של תאים מסוגים שונים, כל אחד עם mRNA פרופילים שונים. היכולת קציר תאים בודדים מאפשר יותר בחקירה לעומק את ההבדלים מולקולרית בין ובתוך אוכלוסיות תאים. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה של קצירת התאים לעיבוד נוסף. Pipettes משמש לעיתים קרובות electrophysiology מנוצלים לבודד (באמצעות שאיפה) תא עניין ובנוחות להפקיד אותו לתוך צינור Eppendorf לעיבוד נוסף עם כל מספר של טכניקות הביולוגיה המולקולרית. פרוטוקול שלנו יכול להיות שונה לקציר של דנדריטים של תרבית תאים או אפילו תאים בודדים מתוך פרוסות חריפה.

כמו כן, אנו מתארים את שיטת הגברה ארנה כיישום הזרם העיקרי של isolations תא בודד. שיטה זו פותחה בעבר כחלופה אחר ביטוי גנים טכניקות ניתוח כגון שעתוק, הפוך או בזמן אמת שרשרת התגובה פולימראז (PCR) על ידי המעבדה שלנו. ^4,5,6,7,8 טכניקה זו מאפשרת הגברה ליניארית של RNA polyadenylated החל femtograms רק של החומר וכתוצאה מכך כמויות מיקרוגרם של antisense RNA. החומר מוגבר באופן ליניארי מספקת הערכה מדויקת יותר מאשר הגברה PCR מעריכי השפע היחסי של מרכיבי transcriptome של התא המבודד. ההליך הבסיסי מורכב משני סיבובים של הגברה. בקצרה, RNA פולימראז אתר מקדם T7 הוא שולב cDNA גדילי כפול נוצר מתוך תמלילי mRNA. לילה שעתוק במבחנה (IVT) התגובה מתבצעת לאחר מכן שבה T7-RNA פולימראז מייצר תמלילי antisense רבים מן cDNA גדילי כפול. הסיבוב השני חוזר על התהליך הזה, אבל עם כמה הבדלים טכניים מאז חומר המוצא היא antisense RNA. זהו תקן לחזור על הסיבוב השני, וכתוצאה מכך שלושה סיבובים של הגברה. לעתים קרובות, בסיבוב השלישי בתגובה שעתוק במבחנה מבוצע באמצעות triphosphates nucleoside biotinylated כך RNA antisense המיוצר יכול להיות הכלאה ו זוהה על microarray. ^7,8

Protocol

1. תא תרבות

המעבדה שלנו משתמשת העיקרי בתרבויות עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס עבור הניסויים בהמשך. להלן תיאור פרוטוקול בנקאי שונה כיצד בתרביות תאים אלה נוצרים ומתוחזק. ⁹ יש, כמובן, מספר ממצה של פרמוטציות של טכניקות אלה culturing התא כל שיטה הוקם המותאמים לצרכים הספציפיים של מעבדה מסוים המספק אספקת בריא באופן עקבי של התאים תהיה תחליף מתאים.

1. חמש autoclaved, עגולים, 12 מ"מ coverslips ממוקמות בצלחת 35 מ"מ מצופה 80 מיקרוגרם / מ"ל ​​Poly-D-ליזין (MW 70-150,000) ב borate חיץ O / N, שטפה עם מים (תרבות כיתה התא), ואז מצופה מיקרוגרם 1 / Laminin מ"ל borate חיץ O / N אז שטפה שוב עם מים. NG מדיה (ממ עם מלחים של ארל ו GlutaMAX בתוספת גלוקוז (0.6% w / v), פניצילין (100 U / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), סוס בסרום (10% v / v)) הוא הוסיף ומנות נשמרות באינקובטור (5% CO ₂ ב 37 ° C). PDL150/laminin משמש מצע של נוירונים בודדים לצמוח כמנהל monolayer. Coverslips יכולים להיות מצופים עד שבועיים לפני ציפוי.
2. ביום ציפוי, הנוירונים העיקריים מן עובריים 18 יום חולדה hippocampi הם מצופה בתקשורת NG ידי הוספת 1.5 מ"ל של 100,000 תאים / מ"ל ​​ההשעיה. ארבע עד שש שעות לאחר ציפוי, כל מנה 35 מ"מ מטופל עם μL 0.75 של 5 מ"מ ציטוסין beta-D-arabinofuranoside (Ara-C) כדי למנוע הצמיחה של כל ותאי גלייה מזהם. עשרים וארבע שעות מאוחר יותר, התקשורת ציפוי משתנה ממ עם מלחים של ארל ו-L-גלוטמין בתוספת 0.6% w / v גלוקוז, נתרן pyruvate 1 מ"מ, ו - B27. תאים מותר לגדול במשך שבועיים לפחות לפני השימוש בניסויים כלשהו כדי לאפשר התפתחות מלאה של התהליכים.

2. הכנת pipettes

הערה על RNases: עור, רוק, ואפילו נשימה הם המקורות העיקריים של RNases, אנזימים לבזות RNA. זה הכרחי כי RNase ללא טכניקה לצפות מנקודה זו ואילך בפרוטוקול כך המדגם לא להזדהם עם RNases ובהמשך לבזות. זה כולל תמיד לובשת כפפות בעת הטיפול דגימות ריאגנטים, מעולם לא מדבר על דוגמאות או חומרים כימיים, וכן באמצעות תיבות החדש של טיפים פיפטה וצינורות מעוקרים. לעתים קרובות, טפטפות שאינן מיועדות אך ורק לעבודה RNA הם חיטוי על ידי מנגב אותם עם פתרון טיפול RNase כגון RNase חוץ (Bioproducts מולקולרית). עם זאת, הפתרונות הללו תעכב תגובות אנזימטיות הזרם כל כך חשוב גם על מנת למנוע זיהום של דגימות שלך עם טיפולים אלה.

1. החיטוי 1.5 מ"מ קוטר חיצוני (OD) זכוכית pipettes.
2. בעזרת חולץ micropipette, למשוך pipettes לקוטר המתאים הקלטות אלקטרו, אשר עשוי להשתנות בהתאם חולץ שלך, נימה, ו pipettes. ¹⁰ גודל נשא אינו קריטי מדי מאז קצה יישבר קודם אוסף תאים.
3. בזהירות בחנות pipettes בסביבת אבק ללא שבו טיפים יישאר ללא שינוי (רצוי להשתמש קנקן micropipette).
4. כדי לשבור את קצה בצורה מבוקרת, לקיים kimwipe מתוח בין האצבעות ביד אחת בעדינות את קצה המכחול פיפטה על פני 1-2 פעמים הנייר. הפתיחה צריכה להיות כ 75-100% של גודל תא היעד. התאם שלב זה עד לך להשיג את התוצאה הרצויה.

3. הכנת תרבות, צינורות, ו מיקרוסקופ

1. הכן את המספר הרצוי של 1.7 צינורות מ"ל Eppendorf. הוסף 2 μL של חיץ, גדיל PBS הראשון, אם החומר הוא לשמש amplifications תא בודד, או כל פתרון אחר לאחסון החומר נאסף.
2. לקציר, תצטרך מיקרוסקופ אור עם מטרה 40X מצויד micromanipulator. השתמש בעל טפטפת עם צינור גמיש המוביל מן המחזיק. לצרף את צינורות אל משטח יציב כדי למנוע תנועה לא רצויה של פיפטה במהלך איסוף. בסופו של צינורות, הכנס מחט כך מזרק 1 מ"ל עם חיבור Luer-Lock יכול להיות מצורף השתנה בין משתמשים.
3. אם אתה משתמש coverslips, לעבוד עם coverslip אחד בכל פעם. במידת הצורך, להעביר coverslip יחיד צלחת 35 מ"מ * חדש המכיל PBS או התקשורת של בחירה. ככל התאים מתוך האינקובטור, בריא יותר הם יהפכו וככל פרופילים mRNA שלהם יהיה לסטות מזה של תא בריא. זה קריטי לשמירה על בריאותם של התאים על coverslips אחרות על ידי שמירה על אותם בחממה כאשר לא לעבוד איתם. עבודה מהר ככל האפשר עם תאים מחוץ לחממה.

* עם ההגדרה שלנו יש צורך להשתמש במכסה של קערת 35 מ"מ מאז קירות צלחת בפועל גבוהות מדי, כדי לאפשר התקדמות נאותה של micropipette לכיוון coversliעמ '

4. קצירת התאים

1. אבטח את micropipette ב בעל micropipette. להטביע micropipette בעל להכניס את על micromanipulators. הגדר את מטרת 40X.
2. מניחים את המנה על הבמה מיקרוסקופ למצוא באזור של תאים מתאים הקציר. במקרה של תרבויות העצבית העיקרי, התא צריך להיות מבודד יחסית לשכנותיה כדי למנוע יבול של התאים הסמוכים ו / או תהליכים. אוכלוסיית תעתיקי mRNA בין סומה תהליכי להשתנות, ולכן אם מעוניין סומטיים mRNAs בלבד, יש להקפיד על מנת למנוע זיהום של סומה עם תהליכים. הנח את תא אתה רוצה לקצור במרכז שדה הראייה.
3. השתמש micromanipulator לקדם את micropipette לקראת פתרון של התבשיל לתוך נתיב האור. מנמיכים את קצה פיפטה לתוך התמיסה. החל לחץ חיובי מנקודה זו על ידי נושבת בקלילות דרך המזרק. תסתכל דרך העינית. פיפטה אמור להופיע כצל בתחום התצוגה. ובכן מעל למישור של התאים, להתאים את המיקום של קצה פיפטה עד שהוא בתוך שדה הראייה ולהתמקד קצה פיפטה באמצעות ידיות התמקדות גס. בשלב זה, יש לבחון אם גודל נשא של פיפטה גדולה מדי או קטנה מדי. קצירת עיסוק תספק את היכולת לקבוע אם גודל נשא לתקן הושגה בשלב זה.
4. עכשיו, לקדם את פיפטה לעבר המטוס של התאים. חשוב קצה אינה מתקדמת במהירות מדי, גורם לו לשבור באזור שממנו אתם רוצים לגבות. כדי למנוע זאת, השתמש להתמקד גס על מנת לקדם את מישור המוקד לפני לקידום קצה פיפטה אל התאים באמצעות micromanipulators. כאשר אתה קרוב תאים, השתמש להתמקד בסדר עד שני התאים את קצה פיפטה נמצאים בפוקוס. עצור הפעלת לחץ חיובי לפני שתגיע מטוס של תאים כדי למנוע פיצוץ של אותם coverslip.
5. השתמש micromanipulators עמדת קצה פיפטה כך נוגע סומה תא ברצונך הקציר.
6. שימוש במזרק, להחיל שאיבה עדינה דרך הפה עד התא נכנס קצה פיפטה. אם התא לא נכנסת פיפטה, להזיז בעדינות את קצה קרוב התא כלפי מטה עד שהוא מרים מן coverslip.

5. שמירת Cell

1. השתמש micromanipulator מיד להעביר את פיפטה מעלה את הפתרון.
2. הסר את פיפטה מבעל.
3. החזק את 1.7 מ"ל Eppendorf צינור ביד אחת בעדינות לשבור את קצה פיפטה בצד של הצינור כלפי מטה. (AIM עבור 0.1 מ"ל סימן.)
4. עם קצה שבור מרוכז בתוך הצינור, להכניס מחט מחוברת למזרק 1-3 מ"ל לתוך הפתח העליון של פיפטה. במהירות לוחץ על המתג לכפות פתרון פיפטה לרסס לתוך הצינור. התא צריך להישאר טיפ מאוד של פיפטה וזה צריך להיות מספיק שצריך לגרש את התא. היזהר שלא לגעת בקצה לנוזל כלשהו על הצדדים של הצינור כפעולה נימי יהיה להחזיר את הנוזל לתוך פיפטה.
5. ספין למטה במהירות את התוכן של הצינור באמצעות microfuge שולחניים להקפיא מיד (החנות ב -80 ° C) או על קרח מקום לעיבוד נוסף (עדיף).

6. ארנה הגברה

1. סיבוב 1 סינתזת גדיל ראשון cDNA:
   יצירת mRNA / כלאיים cDNA.
   1. במשך כל μL 5 נפח תא בודד אוסף, להוסיף 1x מהפעולות הבאות כדי צינור האיסוף (על הקרח). התגובה יכולה להיות scaled עד כרכים עבור אוסף גדול (10 כרכים 2x עבור אוסף μL וכו '). יצירת תערובת אמן על ידי הכפלת ריאגנטים הבאה במספר צינורות אוסף פלוס 10-20% כדי להסביר pipetting שגיאה. האם זה מאוחר מדי עבור תגובה בהליך ampification ארנה.
      • ON ICE
      • 1.2 μL dNTP של (2.5 מ"מ כל אחד)
      • 2.4 גדיל μL 5x ראשון חיץ
      • 0.3 μL T7-אוליגו (DT) פריימר (100 ng / μL)
      • 1.2 DTT μL (100 מ"מ)
   2. תביאו את נפח עד μL 10.25 עם מים חינם nuclease. לערבב פיפטה ספין בקצרה באמצעות microfuge.
   3. דגירה למשך 5 דקות בשעה 70 ° C עד לפגל כל מבנה המשני של ה-mRNA. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות.
   4. הוסף (שוב באמצעות שילוב אב):
      • 0.3 RNasin μL (40 U / μL)
      • 0.45 μL כתב עילי III (200 U / μL)
      • 1 מים μL nuclease חינם
   5. פיפטה לערבב בקצרה ספין. דגירה במשך שעה 1 ב 42 ° C.
   6. לדגור על 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית כתב עילי. המשיכו לשלב הבא.
2. סיבוב 1 סינתזת הגדיל השני cDNA
   צור primers RNA מן החלק של ה-mRNA mRNA היברידי / DNA כדי לסייע סינתזה of גדילי כפול cDNA.
   1. • ON ICE
      • כדי התגובה גדיל μL 12 הראשונים, להוסיף:
      • 8 מים μL nuclease חינם
      • 7.5 גדיל μL 5x השנייה חיץ
      • 0.75 תערובת μL dNTP (2.5 מ"מ כל אחד)
      • 0.25-DNA האנזים μL (10 U / μL)
      • 1 דנ"א פולימראז μL אני (10 U / μL)
      • 0.25 μL Rnase H (2 U / μL)
      מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה עבור 2 שעות 16 ° C.
   2. הוסף: 1-DNA פולימראז μL T4 (5 U / μL). מערבבים על ידי pipetting ובקצרה ספין. דגירה 10 דקות נוספות ב 16 ° C.
   3. לנקות את התגובה באמצעות MinElute Qiagen הערכה לפי הוראות היצרן עם שינויים קלים: ¹¹ Wash 2 פעמים עם חיץ 500 לשטוף μL במקום פעם 1 עם μL 750. Elute במים nuclease חינם.
   4. להתרכז כדי μL 2-4 באמצעות Speedvac או על ידי משקעים אתנול. עבור המשקעים אתנול, גליקוגן המעשים כנשא חומצות גרעין מזרז משמש כאשר כמויות קטנות של דנ"א או רנ"א. נתרן אצטט מתוך נתרן עוזר לנטרל את מטען שלילי של עמוד השדרה DNA, בסיוע בכמות המשקעים. אין צורך להכין תערובת אב precipitations שגרתית.
      • מוסיפים מים 29 DEPC μL
      • 2 הגליקוגן μL (5mg/mL)
      • 1 / 10 נפח (3 μL) נתרן אצטט 3M
      • 2.5 כרכים (~ 250 μL) 100% אתנול קר
      מערבבים היטב. להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N).
   5. צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C.
   6. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 70% אתנול 800 μL. הקפד מלא לעקור את גלולה או על ידי pipetting או vortexing לסייע בסילוק עודפי מלח.
   7. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C. הסר את supernatant ואוויר יבש במשך 15-20 דקות.
   8. Resuspend ב μL 4 מים חינם nuclease. חנות ב -20 או -80 ° C או להמשיך לשלב הבא.
3. סיבוב 1 ב שעתוק במבחנה (IVT):
   Antisense לסנתז RNA מן האמרגן T7 שולבו cDNA גדילי כפול.
   1. תגובה זו מתבצעת באמצעות MEGAscript Ambion T7 הערכה לפי הוראות היצרן, למעט מדורגים עבור μL 10 במקום תגובה 20 μL. ¹² זה הכרחי כדי להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר כדי לשמור על חיץ בטמפרטורת החדר במהלך העצרת. המאגר יהיה סיפק להאיץ את ה-DNA אם הוא קר כקרח. שמור את NTPs ומערבבים האנזים על הקרח כאשר אינו בשימוש.
      • בטמפרטורת החדר
      • מעבירים את cDNA גדילי כפול resuspended אל צינור דק PCR חומה.
      • הוסף 4 μL NTP לערבב (18.75 mM כל אחת)
      • 1 μL התגובה 10x חיץ
      • 1 μL אנזים 10x לערבב
   2. דגירה 14 שעות ב 37 מעלות צלזיוס thermocycler (עדיף) או בחממה.
   3. תגובה זו ניתן לנקות באמצעות שתי שיטות שונות ואחריו ריכוז של המדגם באמצעות Speedvac משקעים או אתנול. עבור ניקוי בעזרת ערכת, המשך א שיטה לנקות עם החילוץ פנול / כלורופורם סטנדרטי, המשך שיטת B.
   4. שיטה א:
      1. לנקות את התגובה באמצעות ערכת AMBION Megaclear לפי הוראות היצרן עם כמה שינויים ^13: לשטוף 2 פעמים עם חיץ 500 לשטוף μL במקום פעם 1 עם μL 750. עבור השלב elution, להוסיף 50 μL מים nuclease חופשית אל מרכז הטור, דגירה על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ספין על g 10,000 דקות 1. חזור בצינור טריים. שלב eluates. תתרכז מדגם μL 2-4 באמצעות Speedvac או על ידי משקעים אתנול.
      2. עבור משקעים אתנול: אמוניום אצטט משמש במקום נתרן אצטט במקרה זה כי היא יעילה במניעת שיתוף משקעים של נוקלאוטידים חינם עם חומצת גרעין. זה חשוב כי ריכוז גבוה של NTP משמש בתגובה IVT, אשר יכול לעכב תגובות במורד הזרם.
         • מוסיפים מים 50 DEPC μL
         • 2 הגליקוגן μL (20 מ"ג / מ"ל)
         • 0.6 כרכים (37.2 μL) אמוניום אצטט 5M
         • 2.5 כרכים (~ 180 μL) קר אתנול
      3. להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N) .*
      4. צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C.
      5. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 70% אתנול 800 μL (מים חופשי nuclease). הקפד מלא לעקור את גלולה להסיר את כל עודפי המלח.
      6. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C.
      7. הסר supernatant ואוויר יבש 15-20 דקות.
      8. Resuspend גלולה במים 4 nuclease μL חינם.
   5. שיטה ב:
      1. לחלופין, ארנה ניתן לנקות עם החילוץ פנול / כלורופורם סטנדרטי.
         • מוסיפים מים 50 DEPC μL
         • 2 הגליקוגן μL (20 מ"ג / מ"ל)
         • 0.6 כרכים (37.2 μL)אמוניום אצטט 5M
         • 1 נפח (98 μL) פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול 25:24:1 (equilibrated עד pH 7.8-8.0)
      2. וורטקס למשך 15 שניות. צנטריפוגה עבור 1.5 דקות בחצי המהירות המקסימלית ב microcentrifuge העליון בטבלה. מעבירים את השכבה המימית מלמעלה צינור חדש המכיל 2.5 כרכים (245 μL) של אתנול קר.
      3. להאיץ ב -80 ° C (30 min. ל O / N).
      4. צנטריפוגה במשך 20 דקות 4 ° C.
      5. הסר supernatant ולשטוף גלולה עם 70% אתנול 800 μL (מים חופשי nuclease). הקפד מלא לעקור את גלולה להסיר את כל עודפי המלח.
      6. צנטריפוגה לעוד 20 דקות 4 ° C.
      7. הסר supernatant ואוויר יבש 15-20 דקות.
      8. Resuspend גלולה במים 4 nuclease μL חינם.
         
         * מדגם עשוי להקפיא בטמפרטורה זו במהלך incubations לילה. הוכח כי זה ממש יכול להגדיל תשואה של חומצות גרעין.
4. סיבוב 2 גדיל סינתזה ראשון cDNA
   1. • ON ICE
      • הוסף 1 primers אקראיים μL (0.05 מ"ג / מ"ל) *
   2. מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות.
   3. • הוסף חוצץ 2 μL 5x גדיל ראשון
      • 1 DTT μL (100 מ"מ)
      • 0.5 μL dNTP של (2.5 מ"מ כל אחד)
      • 0.5 RNasin μL (40 U / μL)
      • 1 μL כתב עילי III (200 U / μL)
   4. מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. אפשר לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צעד זה נדרש כדי לאפשר הרחבה של primers אקראי קצר לפני התגובה שעתוק לאחור מתבצע.
   5. דגירה במשך 30 דקות על 42 ° C.
   6. מחממים 5 דקות 95 ° C עד לפגל את הרנ"א ב-DNA / RNA כלאיים. מניחים על קרח במשך לפחות 5 דקות. חנות ב -20 ° C או -80 ° C או מיד להמשיך לשלב הבא.
      
      * ריכוז primers אקראי חשוב. אם ריכוז גבוה מדי, המוצר יקוצצו יותר עם כל סיבוב של הגברה.
5. סיבוב 2 גדיל סינתזה השנייה cDNA
   1. • ON ICE
      • הוסף 2 μL T7-אוליגו (DT) פריימר (10 ng / μL) *
   2. חום במשך 5 דקות ב 70 ° C. מיד מקום על הקרח לפחות 5 דקות. ספין בקצרה.
   3. • הוסף 43.5 μL מים nuclease חינם
      • 15 גדיל μL 5x השנייה חיץ
      • 1.5 תערובת μL dNTP (2.5 מ"מ כל אחד)
      • 2 DNA פולימראז μL אני (10 U / μL)
   4. מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה עבור 2 שעות 16 ° C.
   5. הוסף 2 μL DNA פולימראז T4 (5 U / μL)
   6. מערבבים היטב על ידי pipetting ספין בקצרה. דגירה 10 דקות נוספות ב 16 ° C.
   7. לנקות את התגובה באמצעות Minelute Qiagen ערכת בסעיף 6.2.3.
   8. להתרכז כדי μL 2-4 עם Speedvac או משקעים אתנול כמו בסעיפים 6.2.4 עד 6.2.8.
      
      * הערה ריכוז מניות שונים של T7-אוליגו (DT) תחל בהשוואה לסינתזה גדיל סיבוב בשניה הראשונה cDNA.
6. סיבוב 2 ב שעתוק במבחנה
   ביצוע כאמור בסעיף 6.3.
   1. חזור על סעיפים 6.4-6.6 המספר הרצוי של פעמים. שים לב שכל הסיבוב הבא של תוצאות הגברה ב קצר מוצרי ארנה. מספר סיבובים של הגברה צריך להיות מוגבל מסיבה זו. בדרך כלל, 2-3 סיבובים של הגברה מספיקים כדי להגביר חומר שנקטפו מתא בודד לבצע ניתוח microarray. במקרה של ניתוח microarray, התגובה השלישית בסיבוב IVT מבוצעת באמצעות TotalPrep Illumina קיט הגברה RNA לפי הוראות היצרן. הליך זה כולל ביוטין, שכותרתו UTP לתוך ארנה המשמש לגילוי אז על שבב microarray.
   2. למדוד את הריכוז של ארנה בסיבוב השלישי באמצעות Nanodrop או Agilent Bioanalyzer עם RNA ננו ערכת.

7. נציג תוצאות

יבול מוצלח של תא בודד מתרבויות עצבי ראשוני יכול להסתיים תוך פחות מ 2 דקות, תלוי כישרון (ראה איור 1). עם זאת, זמן הקציר ינועו בין מערכות עם התערבות מניפולציה ניסויית. חשיפת תא בודד הנוהל ארנה (ראה איורים 4 א ו - 4B) תוצאות בכמויות מיקרוגרם של ארנה מוגבר הכולל מייצר שיא רחב אופייני כאשר ניתח עם bioanalyzer (ראה איור 3). שלושה סיבובים ניתן להשלים מינימום של שלושה ימים, המאפשר ניתוח מהיר של ביטוי גנים תא בודד.

באיור 1. מוצג דוגמה יבול מוצלח של נוירון בודד. אנו Selected אזור יחסית בצפיפות נמוכה (A) ומתקדם קצה פיפטה לעבר התא הרצוי (B). התמונה השלישית (ג) מציג את שדה הראיה לאחר התא נקצר. ראוי לציין, כי התהליכים סביב להישאר coverslip.

איור 2. מוצג שתי תמונות של טיפים פיפטה, אשר גודל מתאים קצירת יעיל. טיפים אלו יוביל קציר שלם (א) ו קציר סביב המילייה (ב) בהתאמה.

איור 3. הקציר הבאים, ניתוח הגברה באמצעות bioanalyzer מומלץ לבחון את התפלגות וכמות של רנ"א מוגבר. הגברה מוצלח מחומר תא בודד תניב סך של מיקרוגרם נמוך תהיה חלוקה זה חלק רחב.

איורים 4. שרטוטים של הסיבוב הראשון (A) בסיבוב השני (B) של ההליך ארנה מוצגים.

Discussion

הערות ופתרון בעיות

• מומלץ לקחת לפני ואחרי תמונות מראה כי תא היעד היה מבודד וכי הילה הנותרים נותר ללא שינוי.
• אם הפתרון יותר מדי נכנסת פיפטה כפי שאתה קציר, אתה יכול להשתמש 3 דרך Luer-Lock אביזרי על הבוכנה של המזרק כדי להחזיק לחץ חיובי בצינור. הנפח הרצוי ישתנו עם סוג של עיבוד אבל עד 5 μl אמור להיות בסדר עבור רוב היישומים.

טיפים כלליים על שיטות ביולוגיות מולקולריות

• וורטקס כל צינורות מניות ספין אותם לפני הוספת התגובה. לעולם אנזימים מערבולת.
• לערבב ביסודיות התגובות לפני הוספת האנזים על מנת להבטיח כי המאגר הינו בריכוז הנכון.
• שמור על מניות אנזים ב -20 ° C ואם אפשר באמצעות stratacooler. אחרת, להסיר מיד לפני השימוש, לשמור על הקרח, ולחזור מיד -20 ° C.
• תמיד לעשות מאסטר מתערבב בעת הכנת אחד או יותר התגובה כדי להפחית טעויות pipetting. חשב את נפח הנדרש מבוסס על מספר דוגמאות ולהוסיף 10-20%.
• חנות RNA ב -80 ° C עד השפלה מפגר. RNA הוא היציב ביותר מאוחסנים חיץ apurination מפגר של רנ"א מתרחשת בתנאים חומציים.

תרשים כללי של נוהל ארנה

איור 4A מדגים את הסיבוב הראשון של ההליך ארנה. בתגובה הגדיל הראשון, החלק poly-T של פריימר (DT) T7-אוליגו בוחר עבור מינים mRNA (מלבן לבן ארוך) באמצעות קשירה של זנבות פולה. רנ"א חלקם polyadenylated גם יהיה שנתפסו על ידי הליך זה. וחשוב יותר, עם זאת, RNAs הנפוץ ביותר בתא, RNAs ריבוזומלי, לא. אוליגו זה משמש פריימר עבור transcriptase הפוכה לסנתז גדיל משלים של cDNA (מלבן אפור ארוך) באמצעות ה-mRNA כתבנית. החלק T7 של פריימר (DT) T7-אוליגו משלבת את האמרגן T7-RNA פולימראז בתוך מסגרת עם antisense את רצף ה-mRNA אל ההתחלה. זה משמש מאוחר יותר את התגובה במבחנה ב שעתוק.

בשלב הבא, ה-mRNA ב היברידית mRNA / DNA שנוצר בשלב הקודם הוא הידרוליזה חלקית על ידי Rnase H ליצירת רנ"א "פריימרים" (מלבנים לבנים קטנים) דומה שברי Okazaki נוצר גדיל DNA סינתזה מפגרת. פולימראז ה-DNA אני משתמשת שברי RNA סינתזה DNA הממשלה באמצעות DNA משלים mRNA כתבנית. כשזה מגיע קטע הבא RNA, שלה 5 'ל 3' פעילות nuclease מסיר את ribonucleotides ומחליף אותם עם deoxyribonucleotides. האנזים דנ"א מתווסף ולקשור כל גדילי שם החלפת גדיל מוביל אינה שלמה. פולימראז ה-DNA T4 הוא הוסיף למלא את האזורים בהם שברי RNA שימש primers הראשוני פולימראז ה-DNA אני יוצר בוטה, הסתיים גדילי כפול cDNA כלומר מטוהרים אז לפני ביצוע התגובה IVT.

בתגובה IVT, T7-RNA פולימראז נקשר האמרגן T7 שולבו הכפול תקועים cDNA ו מסנתז antisense מולקולות RNA (מלבנים שחור ארוך) באמצעות גדיל תחושה כתבנית. זה משמש כצעד הגברה שבו אלפי מולקולות RNA antisense מיוצרים מולקולה כפולה כל cDNA תקועים (איור 4 א).

הסיבוב השני, כמתואר באיור 4 ב ', מתחיל עם תגובה שעתוק לאחור כי שונה במקצת מזו של הסיבוב הראשון מאז RNA המוצא היא antisense (מלבן שחור מוצק) וחסר הזנב polyadenylated כי היה ממוקד על ידי T7-אוליגו (DT) תחל בסיבוב הראשון. לכן, התגובה הזו היא ערוכה עם primers אקראית (קטן מלבנים אפורים) ו-RNA מפוגל לאחר מכן. התגובה גדיל השני הוא דרוך מכן על ידי פריימר (DT) T7-אוליגו, אשר נקשר את רצף פולי-A בסוף '3 של ה-RNA תחושה שנוצר בתגובה שעתוק שקדמו הפוך. תגובה נוספת IVT מתבצע באותו אופן כמו בסיבוב הראשון. בסיבוב השני הוא חזר על זה בדרך כלל לפחות פעם אחת להשיג שלושה סיבובים של הגברה מתא בודד.

יישומים

טכניקות אשר הצגנו במאמר זה יכול להיות מתורגם למספר רב של יישומים. פרוטוקול יחיד בידוד תא יכול להיות שונה לשימוש פרוסות חריפה. ¹⁴ למרות שטכנית יותר מאתגר, אותם עקרונות יחולו כהכנה זה חלופי. בנוסף, אם הגודל של פיפטה מותאם מעט הקלטות של הפיזיולוגיה של התאים יכולה להתבצע לפני הקציר המאפשר חקירה מבוקר היטב של המנגנונים המולקולריים מאחורי פלטי פיזיולוגיים. עוד שינוי קל הוא לבודד תהליכים סומה התא. ¹⁵ עבור יישום זה, לאסוף גופות בתא עם פיפטה אחת ולאחר מכן לחזור עם טפטפת טריים לאסוף 100-300 dendrit מזוההes או אקסונים לכל צינור האיסוף. ¹⁶

לאחר התאים נקצרו, השוואות שכיחותם של mRNA ויצירות יכול להתבצע בין שונים, גם בתוך אוכלוסיות תאים זהים. שילוב biotinylated-UTP לתוך ארנה בסיבוב השלישי מאפשר ניתוח microarray כדי לקבוע אלו שכיחותם היחסית mRNA. הרכב האוכלוסייה mRNA המקורי ניתן גם נקבע לאחר ההליך ארנה באמצעות רצף של הדור הבא. ארנה מוגבר יכול לשמש גם כדי לאשר את פנוטיפ התא המרה מחקרים בהם סט מלא של mRNAs מסוג אחד לתוך תא transfected סוג תא אחר כדי לגרום למעבר של פנוטיפ של סוג התא האחרון לתוך כי לשעבר, הליך שפותח על ידי המעבדה המכונה TIPeR. ¹⁷ מחקרים אלה הם שימושיים במיוחד עבור הלומדים מדינות מחלות פנוטיפים התא מחקרים כאלה מתקיימים כיום במעבדה. RT-PCR או qPCR יכול להתבצע על החומר מוגבר כדי לאשר את הביטוי של גנים ספציפיים בתא. בנוסף, הערכות של היעילות של transfection או התמרה יכול להתבצע ברמת תא בודד.

יתרונות ומגבלות

כאמור באופן מופשט, בידוד של תאים בודדים לניתוח מבטל את ההשפעות בממוצע ראיתי עם ניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תופעות בממוצע לסלף שכיחותם mRNA בתוך תא בודד על ידי יתר המייצג תמלילי שפע בממוצע בחוץ ומניעת גילוי נמוכה שפע תעתיקים רבים. Cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי למיין תאים בודדים, אך שיטה זו דורשת ידע סמנים ספציפיים של התא וציוד יקר. ללכוד ¹⁸ microdissection לייזר או עם UV או IR microdissection מערכות לייזר ללכוד לאפשר תא בודד ואפילו ללכוד subcellular אבל דורש תאים עניין להיות ממוקם על פני השטח של חלקים דק מאוד. ¹⁹ בדומה cytometry זרימה, microdissection לייזר ללכוד גם דורש ציוד יקר.

אחד היתרונות העיקריים של השיטה אלקטרודה מבוסס אוסף שתוארו לעיל היא כי נתונים אלקטרו יקר ניתן להשיג התא עניין לפני הקציר, דבר המאפשר ניתוח פונקציונלי transcriptome להתבצע על באותו תא. ²⁰ החיסרון של הטכניקה שלנו זה דורש ניסיון באמצעות micromanipulators. החוקרים מכירים micromanipulators ימצאו טכניקה זו מאוד אינטואיטיבי, עם זאת, אנשים עם ניסיון כזה צריך להיות נוח עם התנועות בסדר הנדרש.

הטמון בטכניקה כל הגברה היא הגברה מועדף של תמלילי מסוימים על סמך גודל והרכב נוקלאוטיד. ^4,6,7 שרשרת פולימראז התגובה (PCR) טכניקות המבוססות כגון תגובה הפוכה תעתיק פולימראז שרשרת (RT-PCR) ו הגברה המהירה של cDNA מסתיים (RACE) לגרום הגברה אקספוננציאלית של תמלילי, בעוד ההליך הגברה תוצאות ארנה ב הגברה ליניארית. לכן, אחד היתרונות הגדולים של ההליך ארנה הוא ביכולת טובה יותר לשמר את שכיחותם היחסית של תעתיקי mRNA רק באופן ליניארי על ידי הגברה שגיאות או הטיות המתרחשות בתהליך הגברה בניגוד הגברה אקספוננציאלית אמר שגיאות הטיות.

ההליך ארנה בשילוב עם ניתוח microarray מאפשר להשוות את שכיחותם mRNA בין תאים בודדים של מורפולוגיה דומה או שונה, או מטופלים מטופל. בנוסף, חומר מוגבר ניתן להגיש עבור סידור הדור הבא. ^5,8 עם זאת, יש להיזהר בניתוחים כאלה שכן, בניגוד לשימוש primers אקראי עבור ההליך, את ההליך אוליגו DT-דרוך שתוארו לעיל הגברה הטיות של "3 הקצוות של ה-mRNA, ובדרך כלל התוצאות קיצור קל של חומר מוגבר לאחר מכן עם כל סיבוב. יש להקפיד בניתוח תוצאות microarray עם שיטות סטנדרטיות כמו כמה שיחות נעדר שווא יכול לנבוע חומר מוגבר מקוצרת מעט. בנוסף, תוצאות תוך רצף אכן מספקים את מלוא 5 "רצף של רוב mRNA המקורי, 5" רצפים של mRNA מסוימים עשויים לפספס. מסיבות אלה, מספר סיבובים של amplifications צריך להיות מוגבל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511