JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

Abstract

בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים יחד neuroepithelium אזור חדרית במהלך הפיתוח של הצלחת קליפת המוח. אלה אבות מוקדם בסופו של דבר להצמיח אבות ביניים מאוחר יותר, תת שונים תא עצב גליה היוצרות את קליפת המוח. היכולת ליצור ולהרחיב NSCs האנושי (מה שנקרא neurospheres) מרקמות מושלך העובר נורמלי מספק אמצעי שבעזרתו ישירות במחקר היבטים פונקציונליים של אדם נורמלי NSC פיתוח 1-5. גישה זו יכולה גם להיות מכוונת כלפי דור NSCs מהפרעות נוירולוגיות ידוע, ובכך והנותן את ההזדמנות כדי לזהות תהליכים המשנים התפשטות מחלת אבי, הגירה בידול 6-9. התמקדנו בזיהוי מנגנוני פתולוגיים האדם NSCs תסמונת דאון שעשוי לתרום פנוטיפ המחלה אלצהיימר מואצת 10,11. גם in vivo ולא במודלים חוץ גופית העכבר יכול לשכפל את הרפרטואר זהה של גנים בכרומוזום האנושי 21.

כאן אנו משתמשים בשיטה פשוטה ואמינה כדי לבודד תסמונת דאון NSCs מ בוטלה קליפת המוח העוברי האנושי לגדל אותם בתרבית. מתודולוגיה מספקת להיבטים ספציפיים של קצירת לנתיחה, רקמה עם ציוני דרך אנטומיים מוגבל, מיון התא, ציפוי passaging NSCs של האדם. אנו מספקים גם כמה פרוטוקולים בסיסיים גרימת הבחנה של NSCs האדם לתוך תת תא בררניים יותר.

Protocol

1. ההכנה של פתרונות וחומרים לנתיחה ותחזוקה של תרבות גזע עצביים תא

  1. הכן 100 מ"ל בינוני דיסקציה (בנוקאאוט DMEM/F12, Invitogen) מראש ושומרים במקרר.
  2. Prepare100 מ"ל בינוני תרבות (גזע Pro NSC SFM, Invitrogen) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. הכן תא הקפאה בינוני (בנוקאאוט DMEM/F12 10% FBS + DMSO 5%) עבור cryopreservation ארוך טווח של תאים.
  4. אם תרצה, להכין paraformaldehyde 4% (PFA) עבור קיבעון רקמות.
  5. סטרילי, מלקחיים autoclaved ולהבי אזמל עם ידיות משמשים לניתוח.
  6. מניחים בצד אקדח פיפטה, 10 מ"ל pipettes ההעברה, ו -40 מיקרומטר תא מסננת (BD פלקון 352340) על ניתוק.
  7. מניחים בצד כמה 10 ס"מ תרבות מנות (BD) לנתיחה, 50 מ"ל צנטריפוגות מבחנות (BD) עבור דיסוציאציה, 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל לאחסון רקמות צלוחיות קפוא (BD) עבור תאים מקפיא.

2. בידוד אנושי בתאי גזע עצביים מהמוח עוברי אדם

  1. קציר של רקמת קיימא מיד לאחר סיום של העובר היא חיונית להצלחת התהליך. עבור פרוצדורות אלקטיבי, העיתוי להשיג דגימות ניתן לתאם מראש כדי לצמצם את זמן לאחר מותו של העובר. המוצרים ההתעברות נקצרים בתוך הליך שעות 2 הודעה, אבל באופן אידיאלי ניתן להשיג על הליכי בחירה בתוך דקות. ברקמות העובר לעתים קרובות הם מקוטעים. עם זאת, באופן כללי חלק ניכר של המוח נשאר שלם לצורך זיהוי חזותי. מגבלות גיל ההריון (GA) נקבעים על פי חוק סטטוטורי, אך בוצעו תוך שימוש בפרוטוקול זה בין 18-22 שבועות GA.
  2. מוח עוברית ממוקם צלחת פטרי 10 מ"ל המכיל קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט. זיהוי חלקים שונים של קליפת המוח על ידי ציוני דרך אנטומיים. גבולות עבור הקורטקס פרונטלי parieto-העורפית מכוונים ידי הצטלבות אקסטרפולציה של מענית המרכזי סדק סילביוס. לנתח רקמה של הקליפה המצחית הקדמית של מענית המרכזי לאורך הגבול של הסדק סילביוס עם להבים כירורגית, והקפד לשמור על החדר בשלמות וללא נזק.
  3. הסר את כל שאריות הדם ואת קרומי המוח מהגוש מופרדים של קליפת המוח הקדמית. אם המדגם הוא באיכות מספקת, הוא אידיאלי לנתח את הבלוק לתוך כמה דוגמאות קטנות למטרות שונות: סעיפים (קבוע paraformaldehyde 4%, PFA) וחלבון / מבחני ה-mRNA (קפוא מהיר -80 ° C).
  4. מעבירים את גוש במוח שנבחרו צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולהוסיף קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט בערך 3 פעמים הנפח של רקמות. בעדינות לנתק את הרקמה על ידי pipetting מכני עם טפטפת להעביר עד 10 מ"ל כל הרקמות נעשית מקוטעת (בדרך כלל 20-30 פעמים), ואז לסנן את התאים באמצעות תא 40 מיקרומטר מסננת (BD פלקון 352340) להשיג תא בודד אחד או ליד ההשעיה.
  5. צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 2000 ו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל טרי בינוני תרבות חמים (גזע Pro NSC SFM), וכן לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
  6. הוסף 5 מ"ל תרבות מדיום חם לתוך כל 25 ס"מ 2 צלוחיות תרבות, ולהעביר 2x10 6 תאים בקבוק אחד. תרבויות נשמרות 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור במשך שבוע 1 לפני הניתוח. שינוי במחצית בינוני פעם בשבוע במשך תרבויות או ניסויים נוספים.

3. Manipulaton בתאי גזע עצביים לאפיון או experimentations נוסף

  1. Neurospheres בדרך כלל הטופס 1-2 שבועות בתנאים תרבות מומלץ בקוטר NSC הנעים בין 200 ל 400 מיקרומטר. Neurospheres בשלב זה יכולה להיות מנותקת עם 0.2 g / L EDTA בסידן ומגנזיום חינם הנקס בינוני (הנקס) בשעה 37 ° C במשך 15 דקות כדי להשיג תאים בודדים. ההשעיה תאים הם הסתחררו ב 2000 סל"ד, ושטף הנקס טריים, replated במדיום חמים תת תרבות.
  2. כדי ליזום בידול, הם תאים ניתק מצופה על poly-D-lysine/laminin 1 coverslips מצופה בצפיפות של 5 תאים לכל coverslip 1x10 (24mmX24mm). בידול Oligodendrocyte מושגת על ידי שמירה על תאים בנוקאאוט DMEM/F12 (Invitrogen, ראשי, MD) 2% B27 (50X, Invitrogen, ראשי, MD) 10 ng / ml bFGF 100 ng / ml ששש + 10ng/ml PDGF-AA ל 2days, ולאחר מכן מעבר המדיום זהה ללא גורמי גדילה לעוד 5 ימים. בידול העצבית מושגת על ידי תאים שמירה ב בנוקאאוט DMEM/F12 2% B27 (50X) למשך 7 ימים. בידול Astrocyte נעשית על ידי תאים culturing ב בנוקאאוט DMEM/F12 FBS 1% במשך שבוע.
  3. Transfection בתאי גזע עצביים עם גנים ניתן לעשות עם תאים ניתק מן preformed neurospheres. הנה, הראינו שתאי הגזע העצביים transfected עם EGFP-C1 ידי electroporation. Electroporation של EGFP-C1 לבנות נעשה באמצעות AMAXA ערכות Nucleofector עבור תאים עכבר גזע עצביים (VPG-1004) עם התקן Nucleofector AMAXA (Lonza AAD-1001), בעקבות הוראה של החברה. בקיצור, ה-DNA 5 מיקרוגרם עם 1 X 10 6 תאים היו מעורבים עם בינוני 100 transfection μl, ולאחר electroporation הדופק, התאים היו resuspended בתאי גזע עצביים שמירה בינוני לתרבות נוספת. התמיינות של תאים transfected עובדו עם ניתוק של ימים neurospheres 3-4 לאחר electroporation, בעקבות אותם הליכים המתוארים בשלב 3.2.

4. הקפאת בתאי גזע עצביים תת תרבות

  1. המתלים התא ניתק הם centrifuged ו resuspended במדיום הקפאה עם ריכוז של 1x10 7 תאים / בקבוקון / ml. לאט לאט להקפיא את התאים -20 ° C, -80 ° C ואז להעביר חנקן נוזלי לאחסון זמן רב.
  2. התאים הם הפשירו מהר עם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים resuspended ב חימם DMEM/F12 10% נסיוב עבור לשטוף, centrifuged להסיר את הקפאת בינוני, ו resuspended במדיום תרבות התחמם.

5. נציג תוצאות:

בתאי גזע עצביים של עובר נורמלי בגיל 18 שבועות גיל הריון היו בתרבית הבאים בשיטות המתוארות ו neurospheres ניתן לראות אחרי שבוע אחד עם סיבוב, גבולות חלקה בגודל אחיד למדי (Fig.2A). Neurospheres אלה יכולים להיות transfected עם EGFP-C1 או מבנים אחרים אחריו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Fig.2B,). Neurospheres הוקמה היו אז ניתק עם EDTA ו מצופה כמו תאים מפוזרים על coverslips מצופה. תאים מובחנים לפי הפרוטוקולים השונים נקבעו עם parafamaldehyde 4% ו מוכתם סמנים שונים סוג תא מסוים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig2C, D, rhodamine) האסטרוציטים (Fig2E, F, rhodamine) ו oligodendrocytes (Fig2G, H, rhodamine). התאים לא עברו electroporation של EGFP היו מובחנים גם לתוך תאים מסוגים שונים ומוכתמת עם סמנים ספציפיים תאים שונים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig3A, B, fluoroscein) האסטרוציטים (Fig3C, rhodamine ו Fig3D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (Fig3E, F, rhodamine).

figure-protocol-7114
באיור 1. סכמטי של תהליך הניסוי לבודד בתאי גזע עצביים מהמוח מושלך עוברי אדם

figure-protocol-7342
איור 2. מובחן הבדיל תאים עצביים propogated אדם במבחנה. (א) Neurospheres מוצגים תחת מיקרוסקופ לעומת שלב להדגים חלק, עגול גבולות הצמיחה המהירה אחרי התרבות למשך שבוע מעל 1. (ב) הכנסת פלסמידים ובונה שונים יכולה להיות מושגת באמצעות transfection. שלושה ימים לאחר transfection EGFP-C1, מספר תאים מראים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק כפי שניתן לראות תחת immunostaining fluoroscein ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי. EGFP-C1 neurospheres transfected הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (C, D), האסטרוציטים (E, F) oligodendrocytes (G, H) וראה תחת הקרינה rhodamine. במקביל, transfected תאים EGFP חיובי מוצגים תחת fluoroscein פלואורסצנטי. תאים transfected (ראשי חץ לבן) הם נבדלים מתאי untransfected (חצים לבנים). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים הם סולם 200 מיקרומטר עבור, 100 מיקרומטר עבור B ו 25 מיקרומטר עבור CH.

figure-protocol-8309
איור 3. Neurospheres ללא transfection הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (A, B, fluoroscein), האסטרוציטים (C, rhodamine, D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (E, F, rhodamine). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים סולם הם 25 מיקרומטר עבור AF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ישנן גישות שונות כלפי רקמות תרבות טריים לייצר שורות תאים אנושיים. מבחינה היסטורית, רקמה טרי כבר קוצרים ותרבותיים מיד לייצר תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית. אולם גישה זו היא מוגבלת בבירור במספר דגימות שניתן להשיג, אשר במקרה של דגימות האדם, הוא בדרך כלל קטן למד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: HD054347 ו NS063997-01 ל VLS. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן לתאי גזע אמפייר סטייט דרך מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות חוזה # C024324 כדי VLS בחלקו. הדעות הביעו כאן הם אך ורק של המחבר ואינן משקפות בהכרח את עמדת מועצת לתאי גזע האמפייר סטייט, מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות, או את מדינת ניו יורק. VLS היא דוריס דיוק קלינית התפתחותית המדען חתן פרס. אנחנו גם להודות לפרופסור טימותי Vartanian עבור מתנתו של Anti-O1, Anti-O4 נוגדנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
נוקאאוט DMEM/F12 Invitrogen 12660-012 דיסוציאציה בינונית
גזע Pro NSC SFM Invitrogen A10509-01 תרבות בינוני
סרום שור עוברית Invitrogen 10091-148 קפוא בינוני
הנקס פתרון (-Ca 2 +, Mg-2 +) Invitrogen 14175-095 דיסוציאציה בינונית
DMSO סיגמא אולדריץ D2650 קפוא בינוני
EDTA סיגמא אולדריץ 431788 דיסוציאציה בינונית
Paraformaldehyde סיגמא אולדריץ 158127 קיבוע פתרון
bFGF R & D 234-FSE בידול בינוני
ששש R & D 1845-SH בידול בינוני
PDGF-AA R & D 221-AA בידול בינוני
B27 Invitrogen 17504-044 בידול בינוני
עכבר אנטי MAP2 סיגמא אולדריץ M2320 1:200
הארנב נגד DCX תא האיתות 4604s 1:200
הארנב נגד GFAP DAKO Z0334 1:200
הארנב Anti-S100B DAKO Z0311 1:200
הארנב נגד O1 מתנות של פרופסור טימותי Vartanian * 01:50
הארנב נגד O4 מתנות של פרופסור טימותי Vartanian * 01:50
40μm מסננת תא BD פלקון 352340

* טימותי Vartanian, MD, PhD, החוג לנוירולוגיה Neuroscience, Weill Cornell Medical College, ניו יורק, ארה"ב

References

  1. Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
  2. Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
  3. Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
  4. Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
  5. Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
  6. Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
  7. Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
  8. Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
  9. Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
  10. Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
  11. Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
  12. Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
  13. Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
  14. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
  15. Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience51

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved