קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Summary

אנו מדגימים יישום מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח כדי לקבוע את השינויים יחסית בעוצמת הקרינה TMRM לפני ואחרי יישום של גירוי מסוים. אנחנו גם מראים יישום בדיקה הקרינה H ₂ DCF-DA להעריך את הרמה היחסית של מינים החמצן מגיב על נוירונים בקליפת המוח.

Abstract

פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (ΔΨm) היא קריטית לשמירה על תפקוד פיזיולוגי של שרשרת הנשימה כדי ליצור ATP. באובדן משמעותי של תאים הופך ΔΨm מדולדל של אנרגיה עם המוות הבאים. מינים חמצן מגיב (ROS) הם מולקולות איתות חשוב, אך הצטברות שלהם במצבים פתולוגיים מוביל סטרס חמצוני. שני המקורות העיקריים של ROS בתאים הם רעלים סביבתיים בתהליך של זרחון חמצוני. תפקוד המיטוכונדריה לבין סטרס חמצוני היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, ולכן היכולת לקבוע ΔΨm ו ROS יכולים לספק רמזים חשובים על מצב פיזיולוגי של התא ועל תפקידו של המיטוכונדריה.

בדיקות ניאון כמה (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) ניתן להשתמש כדי לקבוע Δψm במגוון רחב של סוגי תאים, ואינדיקטורים רבים פלואורסצנטי (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H ₂ DCF-DA) ניתן להשתמש כדי לקבוע ROS . כמעט כל בדיקות הקרינה זמין להערכת ΔΨm או ROS הם אחד האינדיקטורים גל, אשר להגדיל או להקטין את עוצמת הקרינה שלהם ביחס לגירוי אשר מגביר או מקטין את רמות ΔΨm או ROS. לכן, זה הכרחי למדוד את עוצמת הקרינה של בדיקות אלה ברמה בסיסית ואחרי היישום של גירוי מסוים. זה מאפשר לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה בין רמת המחקר ולאחר גירוי. השינוי בעוצמת הקרינה משקף את השינוי ברמות היחסי של ΔΨm או ROS. בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך ליישם את מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח חולדה כדי לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה TMRM בין רמת המחקר ולאחר יישום FCCP, uncoupler המיטוכונדריה. רמות נמוכות של פלואורסצנציה TMRM כתוצאה מטיפול FCCP לשקף את שלילת קוטביות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כמו כן, אנו מראים כיצד ליישם את הקרינה בדיקה H ₂ DCF-DA כדי להעריך את רמת ROS בתוך הנוירונים בקליפת המוח, הראשון בתחילת המחקר ולאחר מכן לאחר היישום של H ₂ O _2. פרוטוקול זה (עם שינויים קלים) יכול לשמש גם כדי לקבוע שינויים ΔΨm ו ROS בסוגי תאים שונים בנוירונים מבודד מאזורים אחרים במוח.

Protocol

1. תא תרבות

1. נוירונים בקליפת המוח הם מבודדים גדל תוך שימוש בטכניקות שתוארו קודם לכן, מצופה על מנות תרבות עם תחתית זכוכית (MatTek Corporation, אשלנד, MA) מצופה פולי-D-ליזין laminin ^1.

2. הכנת פתרונות מניות עבור בדיקות ניאון TMRM ו-H ₂ DCF-DA

1. הכן פתרון 10 מ"מ מניות של TMRM ידי המסת 5.0 מ"ג TMRM ב 1 מ"ל של dimethylsulfoxide נטול מים. זה וורטקס דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך חודש אחד.
2. בשלב הבא, להכין פתרון 10 מ"מ מניות של H ₂ DCF-DA ידי המסת 4.87 מ"ג של H ₂ DCF-DA ב 1 מ"ל של DMSO נטול מים. באופן דומה, זה מערבולת דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך שבוע.

3. עכברוש נוירונים בקליפת המוח Loading עם TMRM ו-H ₂ DCF-DA

TMRM הוא פוטנציומטרית, התא חדיר חיווי ניאון שמצטבר בפנים הטעונה שלילית של המיטוכונדריה. חשוב להשתמש בריכוזים נמוכים (10-50 טווח ננומטר) של TMRM להימנע אוטומטי של מרווה TMRM המיטוכונדריה. ואז, את האות פלואורסצנציה של TMRM ניתן ישירות שיתוף הקשורים ΔΨm על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית. אובדן ΔΨm גורם TMRM לדלוף מן המיטוכונדריה שגורם לאובדן של עוצמת הקרינה. H ₂ DCF-DA הוא התא חדיר בדיקה להמרה DCF-DA ידי esterases תאיים, והתוצאות חמצון שלה DCF ניאון. הריכוז הסופי של H ₂ DCF-DA נע בין 2-10 מיקרומטר ואת זה צריך להיבדק באופן אמפירי בנוירונים נגזר אזורי מוח שונים מאז ריכוזים טעינה גבוה יכול לגרום הרוויה של DCF הקרינה גם בהעדר של H ₂ O _2. הנוכחות של חמצון אנדוגני או אקסוגני כלשהו (למשל, תחמוצת החנקן, חמצן) יגדיל DFC עוצמת הקרינה. להלן, אנו מספקים פרוטוקול לטעינת נוירונים בקליפת המוח עכברוש עם TMRM ו-H ₂ DCF-DA.

1. כדי לטעון את הנוירונים עכברוש קליפת המוח עם TMRM, ראשית, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם המאגר של Tyrode (שכבת טקסט: שחפת: 145 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, 10 גלוקוז מ"מ, 1.5 מ"מ CaCl _2, 1 mM MgCl _2, ו - 10 HEPES מ"מ; להתאים את pH עד 7.4 עם NaOH). לאחר מכן, להכין 20 ננומטר של TMRM על ידי דילול המניה 10 TMRM mM 1 / 1000 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של TMRM המדולל מ"ל 1 של שחפת. דגירה הנוירונים עם TMRM 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, הר צלחת התרבות על הבמה של המיקרוסקופ ולהתחיל הדמיה.
2. כדי לטעון את החולדה הנוירונים בקליפת המוח עם H ₂ DCF-DA, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם שחפת. בשלב הבא, להכין 2 מיקרומטר של H ₂ DCF-DA על ידי דילול 10 מ"מ H ₂ DCF-DA המניה 1 / 10 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של בדילול H ₂ DCF-DA לכל 1 מ"ל של שחפת. ואז, דגירה הנוירונים עם H ₂ DCF-DA 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, לשטוף את הנוירונים 4 פעמים עם שחפת להסיר אינדיקטור ניאון עודף לפני קבלת תמונות.

4. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM לקבוע ΔΨm

1. כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM, לייזר confocal מיקרוסקופיית (שכבת טקסט: LSM 510, Carl Zeiss Inc), עם יישום התוכנית בזמן סדרת לחיות, משמש. החל ברזולוציה נמוכה ו נחלש כוח לייזר (שכבת טקסט: רזולוציה נמוכה: 256 x 256; כוח לייזר: 1%) כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי להשיג תמונות ולהימנע photobleaching.
2. . בשלב הבא, לכוון את הפוקוס של הנוירונים רכוב עמוסה TMRM באמצעות האור המוחזר. בדוק את הקרינה TMRM על ידי תאורה ב 514 ננומטר וזיהוי ב 570 ננומטר. קבע את הרווח זיהוי של מצלמה מתחת לרמת רוויה.
3. ברגע שכל הפרמטרים אשר כוללים רזולוציה, כוח לייזר, להשיג זיהוי של מצלמה, זמן לשגות מרווח כדי להשיג תמונות מוגדרות, אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. בשלב הבא, לשנות את השדה. התחל באיסוף התמונות.
4. כדי לבחון את השינויים ΔΨm, גירויים כגון 1 מיקרומטר של FCCP או 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של oligomycin, יכול להיות מיושם, אשר ישפר משמעותית depolarize או hyperpolarize פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, בהתאמה. שינויים אלה יבואו לידי ביטוי על ידי ירידה בעוצמת הקרינה TMRM לעומת עוצמת הקרינה הבסיס במקרה של FCCP, או עלייה בעוצמת הקרינה TMRM במקרה של oligomycin.

5. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H ² DCF-DA לקבוע ROS

1. כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H ₂ DCF-DA, הראשון, הר צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ. התאם את המיקוד של התאים לנוing משתקף האור. בדוק DCF הקרינה על ידי עירור ב 488 ננומטר ופליטה ב 515 ננומטר.
2. לאחר מכן, להתאים את כוח לייזר 5-7%, עלייה גלאי, ברזולוציה של 256 x 256. אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. לאחר מכן, קבע את תדר לקבלת תמונות חיות באמצעות תוכנית סדרת זמן.
3. בחר שדה חדש ולהתחיל לרכוש תמונות. כדי לזהות שינויים ברמות ROS, לטפל בתאים עם 100-200 מיקרומטר של H ₂ O _2. זה יבוא לידי ביטוי על ידי עלייה בעוצמת הקרינה DCF, לעומת רמת הבסיס.

6. ניתוח נתונים

1. השתמש באזור של עניין (שכבת טקסט: ROI) כלי מהתוכנית LSM כדי לבחור את אזורי. לאחר מכן, מודדים את TMRM או ROS עוצמות הקרינה. בחר ROIs מאזורים המיטוכונדריה או ROIs מגוף התא כולו בתאים הדמיה כדי למדוד את עוצמות הקרינה של TMRM או ROS, בהתאמה.
2. חשב את עוצמות הקרינה הממוצעת ROIs כל תא עבור TMRM או מגופים תא שלם עבור כל התאים הדמיה עבור ROS לכל נקודת זמן. בחר באזורים ליד התאים כדי לחשב את עוצמת הקרינה רקע. קח כמה מדידות ולחשב את עוצמת רקע הממוצע.
3. הפחת את הרקע ממוצע עוצמת הקרינה של עוצמות הקרינה הממוצעת של ROIs בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת רקע, לנרמל את עוצמת TMRM או DCF פלואורסצנטי הקרינה הבסיס באמצעות הנוסחה (שכבת טקסט: ΔF FF = _o / F _o x 100, שם F = עוצמת הקרינה בכל נקודת זמן, במשך = הבסיס הקרינה). ואז, להשתמש בתוכנית מגרש Sigma כדי ליצור את העלילה מראה את השינויים בעוצמת הקרינה לאורך זמן.

7. נציג תוצאות

איור 1 א מציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש מודגרות עם TMRM. הוספת FCCP, uncoupler המיטוכונדריה, מוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה לבין הפסד של עוצמת הקרינה TMRM (איור 1B). הרמה הבסיסית TMRM הקרינה נותר יציב לפני תוספת של FCCP (הראשון 350 שניות;. איור 1C). ניתוח כמותי של שינויים TMRM הקרינה לאורך זמן מראה ירידה משמעותית הקרינה TMRM לאחר תוספת של FCCP (איור 1C).

1D איור מראה את התמונה פלואורסצנציה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה DCF. תוספת של H ₂ O ₂ תוצאות מוגברת עוצמת הקרינה DCF בגוף התא (איור 1E). הרמה הבסיסית DCF הקרינה היא ללא שינוי (הראשון 120 שניות) לפני היישום של H ₂ O _2. זמן לשגות מדידות של הקרינה DCF להראות רמת סוכר קבועה שלה, להגדיל לאחר הטיפול H ₂ O ₂ (איור 1F).

באיור 1. הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ורמות ROS בנוירונים חולדה חיה קליפת המוח. (א) נציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עמוסה TMRM. לאחר הסריקה הבסיסית TMRM פלואורסצנטי, הנוירונים טופלו FCCP protonophore (1 מיקרומטר). מימין הוא סרגל עוצמת הקרינה של pseudocolor TMRM עם מקסימום בהיר המייצג צהוב ושחור ואת עוצמת המינימום, בהתאמה. ההפסד של הקרינה TMRM מאזורי המיטוכונדריה מצביע על קריסת ΔΨm על FCCP הטיפול (לוח ב '). ייצוג כמותי של שינוי בעוצמת הקרינה TMRM בנקודות זמן שונות לפני ואחרי הטיפול FCCP מוצגת בלוח ג (ד) תמונה פלואורסצנטי של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה H2DCF-DA. לאחר קביעת הבסיס DCF פלואורסצנטי, בתאים שטופלו 200 מיקרומטר H ₂ O _2, והשינוי DCF הקרינה הוערך. גידול הקרינה DCF משקף את העלייה ברמות ROS על טיפול ₂ H ₂ O (E). ניתוח כמותי של שינוי DCF פלואורסצנטי, לפני ואחרי הטיפול H ₂ O _2, מוצג בשורת פאנל סולם פ = 10 מיקרומטר

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
הדמיה של תא חי TMRM בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף FCCP באמצעות המטרה 40X. עוצמת pseudocolor מראה (צהוב בהיר, לפני כן FCCP) המרבי וירידה (צבע אדום, לאחר תוספת FCCP) עוצמת הקרינה לאחר TMRM בנוסף FCCP. לחץ כאן כדי להציג וידאו

וידאו. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
הדמיה של תא חי DCF בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף ₂ H ₂ O באמצעות המטרה 40X. הבסיס DCF הקרינה יש צבע ירוק בהיר בגוף התא H2O2 בנוסף מגדיל את הבירהF עוצמת הקרינה לצבע ירוק בהיר. לחץ כאן כדי להציג וידאו

Discussion

הצגנו הליך צעד אחר צעד מתאר כיצד לקבוע ΔΨm ו ROS ב נוירונים בקליפת המוח עכברוש באמצעות אינדיקטורים פלורסנט TMRM ו-H ₂ DCF-DA, בהתאמה. עבור סוגי תאים אחרים, חשוב לקבוע באופן אמפירי את הריכוז הסופי זמן טעינה עבור TMRM או H ₂ DCF-DA. באופן כללי, טווח הריכוזים TMRM 2-20 ננומטר, ואת זמן הדגירה תא עם TMRM משתנה בין 20 ל 60 דקות. הריכוז הסופי של H ₂ DCF-DA טווחי 2-10 מיקרומטר, ו הדגירה של תאים בתמיסה המכילה טעינת זה סמן משתנה בין 30-45 דקות.

זה חשוב כדי לייעל את כוח לייזר מהירות סריקה של לקיחת התמונות להימנע הן צילום רעילות לתאי שינויים בעוצמת הקרינה (למשל הבהוב של TMRM פלואורסצנטי) בהעדר גירוי כלשהו. ההגדרות אופטי אופטימיזציה צריך להביא אות הקרינה כי הוא לא מעל או מתחת רווי (סף) בהיעדר גירוי. תנאים אופטימליים כדי לאסוף את התמונות משדה שנבחר בהספק לייזר בפרט מהירות סריקה מושגות כאשר אין שינויים בעוצמת הקרינה של החללית בהעדר גירוי כלשהו עבור 10-15 דקות של הדמיה לחיות.

בדיקות הקרינה אחרים כדי לקבוע ΔΨm כוללים rhodamine 123 ו טטרה מתיל אתיל אסתר rhodamine (TMRE). עם זאת, הם נמצאו לעכב את תהליכי הנשימה ² המיטוכונדריה מבודד. חשוב לציין, TMRM אין כל השפעה על הנשימה המיטוכונדריאלי בריכוזים נמוכים ² ויש לו phototoxicity נמוך photobleaching ³ לעומת בדיקות אחרות. H ₂ DCF-DA הוא אינדיקטור טוב עבור ROS כפי שהיא נשמרת גם בתאים ומזהה מינים חמצון שונים, כגון peroxides, תחמוצות סופר, ו תחמוצת החנקן ^4.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
תחתית זכוכית תרבות צלחת	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
NbActive4	BrainBits	NbActive4
TMRM	Invitrogen	T668
H 2 DCF-DA	Invitrogen	C400
NaCl	סיגמא	S6191
KCl	סיגמא	P3911
CaCl 2 • 2H 2 O	סיגמא	C3306
MgCl 2 • 6 שעות 2 O	סיגמא	M2670
D-גלוקוז	סיגמא	G6152
HEPES	Invitrogen	15630