הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Summary

איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב הפירות תסיסנית melanogaster להפוך את האורגניזם כלי פוטנציאל דוגמנות והפרעות מטבוליות כולל סוכרת מסוג II. לשם כך, חיוני להקים מבחני פיזיולוגיים ביעילות למדוד את פעילות האינסולין מערכתי סילוק הגלוקוז הפריפריה הזבוב הבוגר.

Abstract

שימור מנגנוני חישה התזונתיים הקיימים בין יונקים זבוב הפירות שבו פפטידים הדומה אינסולין גלוקגון יונקים, בהתאמה פונקציה לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז ^1,2 במהלך שלבי התפתחות הזחל. מחקרים בעיקר שלאחר mitotic זבובים בוגרים חשפו ההפרעות של הומאוסטזיס הגלוקוז כתוצאה אבלציה הגנטי של פפטיד דמוי אינסולין (ILP) לייצר תאים (IPCs) ^3. לפיכך, זבובי פירות בוגרים לקיים הבטחה גדולה כמערכת מודל מתאים גנטי הפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג II. על מנת להמשיך ולפתח את המערכת זבוב הפירות, מבחני השוואה פיזיולוגית למדידת סבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין אצל יונקים יש להקים. לשם כך, יש לנו תיאר לאחרונה הליך חדשנית למדידת גלוקוז העמסת תגובה לטוס מבוגרים הראו את החשיבות של IPCs מבוגרים בשמירה על הומאוסטזיס הגלוקוז ^4,5. הנה, יש לנו נוהל שונה שתואר קודם להזרקת אינסולין ⁶ בשילוב עם שיטת השאיבה רומן hemolymph למדוד את הרגישות לאינסולין הפריפריה הזבוב הבוגר. באופן ייחודי, פרוטוקול שלנו מאפשרת מדידות פיזיולוגיות ישירה של היכולת לעוף של מבוגר להיפטר עומס הגלוקוז היקפית על הזרקת אינסולין, מתודולוגיה שעושה את זה אפשרי לאפיין מוטנטים אינסולין איתות התערבויות העשויים להשפיע על הסבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין הזבוב הבוגר.

Protocol

1. פתרון אינסולין הכנה

1. הכן אינסולין טרי פתרון שור ידי המסת אינסולין PBS כדי להשיג את הריכוז של 0.01 מ"ג / מ"ל. שניהם אינסולין / PBS ושליטה פתרונות PBS חייב להישמר על הקרח לאורך הליך ההזרקה. פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים עם 0.5% (V / V) FD & C Blue לא. 1 מזון צביעה.

2. מחט הכנה הזרקת הקמה

1. הכן מחטים זכוכית נימי באמצעות puller.The micropipette הבאים הגדרות חולץ לייצר מחטים באיכות מספיק להזרקה: חום, 345; משוך, 210;, מהירות 100, זמן, 200 (100ms). מחטים משך טרי חייב להיות קהה על ידי לחיצה על קצה דרך רקמות Kimwipe. תהליך זה מסיר להקהות את חוד מוארך עמידות גבוהה ומייצרת טיפ יותר שמן עם נקבוביות בקוטר גדול יותר.
2. מקום המחטים הקהה טיפ למעלה בצינור microcentrifuge המכיל את אינסולין / PBS פתרון או PBS לבד. נימי תוצאות הפעולה גב מילוי כל מחט. שים את קצה המחט תחת stereomicroscope, כדי לוודא ששום בועות אוויר פסולת או להופיע בקצה. מחק כל מחטים שלא למלא נקייה.
3. הכנס מלא מחטים לתוך מחזיק microinjector ידני מחט עמדת בעל מחט עם micromanipulator כך חוד המחט גלוי דרך stereomicroscope. להפעיל לחץ חיובי על הטור נוזל המחט על ידי סיבוב ידית ידנית מיקרומטר microinjector המצורפת הבוכנה על המזרק microinjector.
4. ודא כי הלחץ מספיק עקירה נוזל הוחל על ידי נגיעה Kimwipe אל קצה המחט, המאשר זרימת הנוזל.
5. לאחר המחט הוכן הזרקה, להדביק תרשים כיול לפיר מחט עם סרט ברורה, ולהביא את קצה המחט אל המוקד באמצעות stereomicroscope בהגדלה 20X.

3. טוס הכנה

1. עשרה ימים בת זבובים הנקבה משמשים לניסויים ההזרקה. איסוף זבובים בתוך 24 שעות של eclosion. הרדימי זבובים עם CO ₂ humidified על כרית גז, למיין את הזכרים וזבובים המקום הנשי בתוך מבחנות המכילות סטנדרטי או דיאטה טיפול. שמור על זבובים הנשי על דיאטות ניסיונית למשך 10 ימים.
2. ביום העשירי לאחר eclosion והפרדה על דיאטות ניסיוני, העברת זבובים צלוחיות מזון המכילים שלהם בקבוקונים המכילים תקע 5 מ"ל של אגר 2% ולהרעיב אותם במשך 12-16 ח
3. העברת זבובים רעב בקבוקונים המכילים מסנני גלוקוז 10% ספוג שעה 1 לפני הזרקת אינסולין.
4. בקצרה להרדים הזבובים עם ₂ CO humidified לאחר האכלה גלוקוז ואז קר לשתק אותם על הקרח.

4. הזרקת נוהל

1. בעדינות לתפוס זבוב קר משותק עם זוג מלקחיים בסדר להחזיק אותו קרוב קצה המחט, כך קצה צמוד באזור הקדמי של הצד השמאלי של בית החזה של הזבוב. תביאו גם את קצה המחט החזה של הזבוב אל המוקד תחת stereomicroscope.
2. בעדינות להזיז את לעוף לכיוון קצה המחט כך חוד המחט נוגעת מרכז בליטה של ​​האזור prescutum השמאלי של בית החזה של הזבוב (איור 1). לאחר לטוס מכוונת כראוי מיושר עם קצה המחט, להמשיך לקדם את זבוב על המחט כך המחט נועצת את מרכז prescutum.
3. החל לחץ חיובי כנדרש על ידי קידום על הבוכנה מזרק עם ידית micromanipulator של microinjector עד 0.1 μl של נוזל כבר מוזרק לטוס. זרם של נוזל לתוך hemocoel של הזבוב יהיה להקנות צבע כחול בצד שמאל של בית החזה הקדמי. לעיתים יש לחזור ולקדם מספר פעמים כדי לסלק כל חסימה קצה מחט ולאפשר זרימת הנוזל.
4. אפשר זבובים מוזרק להתאושש צלוחיות אגר 2% עבור נקודות זמן המיועד לפני מיצוי hemolymph.

5. Hemolymph אוסף

1. בקצרה להרדים זבובים עם CO ₂ humidified במוצב הזרקת נקודות הרצוי בזמן כל עמדה לטוס הגב בצד למטה על קלטת דו צדדית מודבקת על פני השטח של כרית CO _2. סדר זבובים אפילו שורות עם קפסולות ראש מיושר. אפשר להשתמש במקל המוליך עץ גזומים ללחוץ כנפיהם לתוך דבק קלטת להבטיח immobilization.
2. לאחר זבובים קבועים לקלטת, לתפוס חוטם כל זבוב עם מלקחיים בסדר בעדינות למשוך אותו לכיוון האזור הגחוני ואז האחורי של הזבוב, כך הקדמי של הקפסולה בראש גלוי מבעד למיקרוסקופ סטריאו.
3. עם היד השנייה ובזמן חוטם מחזיק בעמדה, לנקב את מרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal באמצעות מחט טונגסטן חדה (איור 2). יש להיזהר לא להכניס את המחט עמוק מדי כמו קל אגרוף קצה המחט דרך הצד השני של הקפסולה ראש ולאחר מכן לאבד גontrol של זרימת hemolymph. לנקב את כל הזבובים בקבוצה זריקה לפני איסוף hemolymph.
4. לאחר הקפסולה הראש כבר ניקב, השתמש במקל המוליך עץ גזומים בעדינות כדי להפעיל לחץ על הבטן של הזבוב. זה עשוי להיות מועיל לגלגל את לטוס מעל כך שהוא נשען על הצד הגחוני שלה כפי שאתה להפעיל לחץ. הליך זה יהיה לייצר טיפה של hemolymph מאתר הקפסולה ראש לנקב.
5. מגע קצה אחד של צינור microcapillary 1μl כדי אגל hemolymph המתעוררים מאתר הקפסולה ראש לנקב. Hemolymph ייכנסו לפעולה באמצעות צינור נימי. קבע ולהקליט את כמות hemolymph שנאספו על ידי בדיקת נוזל עמוד בתוך הצינור microcapillary נגד תרשים נפח בוגרת.

6. גלוקוז Hemolymph קביעת

1. הוצאת דגימות hemolymph לתוך microplate בארות המכיל 100 μl של גלוקוז מגיב אינפיניטי. שמור על צלחת על הקרח בעת טעינת דגימות hemolymph.
2. הקמת עקומת סטנדרט ידי טעינת בנפרד 1 μl כל המניות של פתרונות גלוקוז ב 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ו 3.125mM.
3. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. זיהוי ספיגת ב 340 ננומטר.
5. חשבון עבור נפח hemolymph אסף לקבוע ריכוז הגלוקוז מדגם המבוססת על עקומת רגיל עם ריכוזי הגלוקוז ידוע.

7. נציג תוצאות

תגובה טיפוסית סבילות לאינסולין מזוהה האינסולין מוזרק זבובים היכן ירידה במחזור רמות הגלוקוז מזוהה 15 דקות לאחר ההזרקה. לעומת זאת, תגובה כזו לא ראיתי אצל זבובי PBS מוזרק (איור 3). זו התגובה סילוק הגלוקוז ההיקפי ממשיך להזריק אינסולין זבובים עד 30 דקות לאחר ההזרקה. אנו שגרתי לחלץ 0.2-0.5 μl של hemolymph לכל 4-5 זבובים בכל קבוצה ההזרקה. שלוש קבוצות הזרקת כלולים כל ניסוי.

באיור 1. בצד שמאל של בית החזה תסיסנית מראה הכניסה מחט באתר (השתנה מ Demerec, 1950) ^7. הכנס את המחט דרך מרכז prescutum על האזור הקדמי של הגב בצד שמאל של החזה.

איור 2. התצוגה פרונטלי של ראש תסיסנית מראה מיקום לנקב להפקת hemolymph (השתנה מ Demerec, 1950) ^7. לנקב את הקפסולה עם ראש בדיקה טונגסטן חידד דק במרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal.

איור 3. אינסולין טיפוסי סובלנות בתגובה זוהה מבוגר לשלוט זבובים. בקרת זבובים w ¹¹¹⁸ הוזרקו אינסולין שור (1 ננוגרם ב PBS) או PBS בלבד. זבובים בקבוצות לשכפל הורשו אז להתאושש במשך דקות 0, 15 או 30 רמות הגלוקוז במחזור נמדדו.

Discussion

הטכניקה שתוארו בדו"ח זה הוא שימושי באופן פוטנציאלי בכל מחקר החוקר תהליכים פיזיולוגיים וכתוצאה מכך לגילוי שינויים בהרכב hemolymph תסיסנית. על ידי שילוב של הזרקה ואיסוף hemolymph באופן זה, ניתן לקבוע את ההשפעות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיידית של טיפול ניסיוני מניפולצ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / ציוד	חברה	מספר קטלוגי
שור אינסולין	סיגמא	I5500
אינפיניטי מגיב גלוקוז	Thermo Electron Corporation	TR1541
ידני microinjector	סאטר Instrument
P-87 Flamming / בראון micropipette חולץ	סאטר Instrument
חבית בודדת נימי זכוכית בורוסיליקט	AM מערכות	626000
FD & C Blue מס '1	מקורמיק & Company
1 צינורות microcapillary μl	דראמונד
שלושה צירים ידני micromanipulator ובסיס	העולם מכשירי דיוק