Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Summary

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Abstract

מכונות דיסוציאציה של נוירונים ממערכת העצבים המרכזית יש את היתרון כי boutons presynaptic להישאר מחובר נוירון בודד של עניין. זה מאפשר בדיקה של שידור הסינפטי בתנאים שבו סביבות תאיים תאי ו postsynaptic ניתן לשלוט היטב. טכניקת הרטט מבוססי ללא שימוש פרוטאזות, המכונה vibrodissociation, היא הטכניקה הכי פופולרי עבור בידוד מכני. Micropipette, עם קצה אש מלוטשת לצורת כדור קטן, מכניסים פרוסת המוח עשוי מכרסם P1-p21. Micropipette הוא רטט במקביל פני פרוסת והוריד דרך עובי פרוסת והתוצאה היא שחרור של נוירונים בודדים. נוירונים בודדים מוכנים ללמוד בתוך דקות ספורות של vibrodissociation. טכניקה זו יתרונות על פני השימוש של תרבויות העצבית העיקרי, פרוסות המוח נוירונים בודדים enzymatically כולל: ייצור מהיר של נוירונים קיימא בוגרת יחסית מתאים מחקרים אלקטרו הדמיה, שליטה מעולה של הסביבה תאיים ללא השפעה של תאים שכנים, התאמתו עבור מבוקר היטב ניסויים תרופתי באמצעות תרופות יישום מהיר הכולל תא superfusion; ושיפור חלל מהדק כולה תא הקלטות יחסית נוירונים פרוסה או תרבות ההכנות התא. הכנה זו יכולה לשמש כדי לבחון הפיזיולוגיה סינפטית, פרמקולוגיה, אפנון הפלסטיות. בזמן אמת הדמיה של שני אלמנטים טרום postsynaptic בתאים boutons החיים ניתן גם באמצעות נוירונים vibrodissociated. אפיון המרכיבים המולקולריים של יסודות טרום postsynaptic יכול גם להיות מושגת עם גישות אימונולוגיות הדמיה מבוססת.

Protocol

1. הכנת להבה זכוכית אטום micropipette

1. באמצעות זכוכית microelectrode, למשוך micropipette תקן תיקון-clamp על Flaming-בראון או שווה ערך micropipette חולץ (טיפ ~ בקוטר 2 מיקרומטר). Micropipette המקום קצה לתוך הלהבה של מבער בונזן עבור ~ 2 שניות עד לקבלת כדור התמזגו עם קוטר של 200-300 מיקרומטר.
2. המקום להבה חתום על תיקון פיפטה מחזיק על micromanipulator שניתן רטט במהירות מצד אל צד (מרחק הנסיעה 100-200 מיקרומטר) באמצעות bimorph פיזואלקטריים, ממסר, או מכשיר יעיל שקול.

2. הכנת פרוסות המוח מ P1-p21 חולדות או עכברים

1. הכן מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF) עם הרכב הבאים (מ"מ): 124 NaCl, KCl 4.5, 1.2 לאא ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, ו 10 D-גלוקוז. פתרון הבועה עם חמצן 95% / 5% CO ₂ גז במשך 15 דקות ~, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"מ CaCl ₂ ו - 1 mM MgCl _2.
2. חיתוך פרוסות המוח:
   1. להרדים בעלי חיים או עם halothane isoflurane. לערוף חיה - להסיר מוח - המוח לחסום בכיוון הרצוי (העטרה, parasagittal, רוחבי, וכו ') לכלול אזורים של עניין.
   2. להטביע במוח נחסם לשלב של מבצעה מוח רוטט שקוע aCSF - המוח סעיף ב עובי 250-400 מיקרומטר - פרוסות מקום aCSF מבעבע עם carbogen ב קאמרית "preincubation" על הרשת, המאפשרת נוזל / גז חשיפה על גבי משטחים כל - לאפשר פרוסות לאזן במדיום הזה במשך שעה אחת לפחות.

3. Vibrodissociation

1. מילוי בקוטר 35 מ"מ תרבות צלחת עם פתרון HEPES שנאגרו מלוחים הרכב הבאים (מ"מ): 150 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 MgCl _2, 2.5 CaCl _2, 10 D-גלוקוז עם pH 7.4 מוגדר באמצעות NaOH ו osmolarity מותאם mOsM 300 ~ באמצעות סוכרוז. מנות התרבות עשוי להיות כלי ההשעיה, תקן תרבות מנות התא, עם מנות התרבות מוסיף coverslip זכוכית, או כלים מצופים, למשל, פולי-L-ליזין, בהתאם לצורך היצמדות התא חזק לתחתית צלחת.
2. מניחים את הפרוסה בצלחת תרבות לדמיין עם stereoscope לנתח ב 250 x. החזק פרוסה לתחתית בעזרת חוט פלטינה מכופף (בקוטר 0.5 מ"מ) ממוקם על המשטח העליון של הפרוסה לשמש משקל.
3. מקם את קצה micropipette להבה חתום על פני השטח את הפרוסה באזור המוח הרצוי. הפעל micromanipulator לרטוט קצה רוחבית ב 10-30 הרץ, עם מרחק טיול ~ 100 מיקרומטר. שימוש micromanipulator, הזז את קצה עמוק יותר לתוך הרקמה פרוסה כזו כי זה עובר דרך פרוסה כולה בתוך ~ 30 שניות. חזור על פעולה זו כנדרש על מנת למקסם את מספר נוירונים בודדים השגה מאזור המוח נתון.
4. הסר את הקצה של הפרוסה - להרים את הפרוסה עם מלקחיים ובעדינות לנער אותו בעודו פתרון - אז להסיר לחלוטין פרוסה וזורקים.
5. אפשר התאים ניתק להתיישב לדבוק לתחתית צלחת דקות לפחות 10.

4. אלקטרו הקלטה

1. מניחים את צלחת ובה נוירונים על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ולדמיין עם x 10-63 x אובייקטיבי. חפש נוירונים עם קרום פטנט חלקה, לא blebbing, ועל גרעין לזיהוי אך לא גדול מדי. אם לעומת זאת אופטיקה שלב משמשים, לחפש שלב נוירונים בהיר עם גוון צהבהב, לא כחול מדי. תאים Superfuse עם פתרון תאי המכיל מלחים המבוקש, מזינים, אנטגוניסטים לקולטן, וכו '(הרגיל שלנו הוא מלח HEPES שנאגרו שהוזכרו לעיל (סעיף 3.1)), בתוספת לעתים קרובות עם 5 מיקרומטר 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [ו] quinoxaline-7-sulfonamide מיקרומטר disodium (NBQX), ו 25-100 D-2-אמינו-5-phosphonopentanoic חומצה (AP5) לחסום קולטני גלוטמט ionotropic המאפשר בידוד של GABA מהר קולטן בתיווך IPSCs ^1,2.
2. משוך micropipette תיקון תקן באמצעות חולץ-Flaming בראון או שווה ערך. התנגדות פיפטה טיפ צריך להיות 2-4 MΩ (תלוי בגודל תא היעד) כאשר מתמלא Cl ^{- -} ​​פתרון מבוסס.
3. הקמת הקלטה כל תא של נוירון דמיינו שימוש בטכניקות אלקטרו סטנדרטית.
4. שיא זרמים postsynaptic ספונטנית (sPSCs) באמצעות הפער ללא פרוטוקול נתונים הרכישה. החל tetrodotoxin 0.2-1 מיקרומטר ו / או Ca ^{2 +} נמוך - המכיל פתרון תאיים להקליט זרמים postsynaptic מיניאטורי (mPSCs).
5. פתרונות סוכנים תרופתי ניתן ליישם ישירות לתאים. אנו משתמשים superfusion מקומי מהכיכר שקצהו צינורות זכוכית התמזגו עם חילופי פתרון מעורבים בתנועה לרוחב של צינורות רכוב על micromanipulator-stepper המנוע מונע. זה Alloהיה להחלפת פתרון 10s כדי 100s של אלפיות כדי להשיג שינויים מהירים תוכן מולקולרית תאית, היישום של אגוניסטים לקולטן, וכו '
6. Akaike ועמיתיו פיתחו טכניקות כדי לעורר boutons presynaptic יחיד ^3,4. Micropipette ממוקם ליד באוטון דמיינו וגירוי ניתנת (זרמים גירוי שלילי של μA 50-10, 0.1-0.2 משך ms). IPSCs לפירוק נרשמות, שיטות כגון השיטה של ​​כשלים ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים בתפקוד presynaptic ו postsynaptic.

5. הדמיה מסופי Presynaptic

1. נוירונים Postsynaptic יכול להיות מלא עם צבעים שונים באמצעות פיפטה את התיקון. נוירונים אפשר גם מעכברים להביע חלבוני ניאון (fps) כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוכלוסיות הסלולר שנבחר.
2. מסופי Presynaptic ניתן דמיינו על נוירונים vibrodissociated עשוי עכברים המבטאים FPS באוכלוסיות interneuron בפרט. לדוגמה, עכברים להביע GFP מונע על ידי decarboxylase גלוטמט 65 (GAD65) להראות האמרגן somata ירוק תהליכים בתאים סל בהיפוקמפוס interneurons אחרים. עצב פירמידליים Vibrodissociated מאזור CA1 בהיפוקמפוס יש GFP חיובי מסופי האקסון apposed כדי somata שלהם דנדריטים הפרוקסימלית (איור 1 א). עצב פירמידליים vibrodissociated מעכברים המבטאים synaptopHlourin (pH רגיש GFP מוטציה התמזגו החלבון הסינפטי VAMP2 שלפוחית ​​הקשורים) תחת שליטה של ​​האמרגן Thy1 יש גם boutons FP-חיובי מצורף להראות כי הקרינה pH רגיש (איור 1B).
3. Boutons Presynaptic ניתן לטעון עם מחוון צבעים סידן מולקולות ניאון אחרים באמצעות תרכובות esterified ^AM-5. תרשים 2 מציג דוגמה טעינה באמצעות סידן אינדיקטור צבע Fluo4-PM. ראשית, 1-2 מיקרומטר AM-esterified לצבוע מוחל על נוירונים ב ° 37 במשך 10 דקות. דאי יכול לחדור לתוך הסביבה תאיים, שם esterases לבקע את המולקולה, מניב לצבוע בחינם, תא impermeant ו unquenched. גישה זו טוענת גם אלמנטים הסלולר טרום postsynaptic. לאחר הטעינה, התאים נשטפים עם פתרון HEPES שנאגרו מלוחים ושמרה על 37 מעלות במשך 10 דקות נוספות. לפני ביצוע GΩ חותם עם אלקטרודה פיפטה זכוכית, התאים הם שטופים 3 פעמים בתמיסת בופר חיצוני.
4. הקלטת כל תא הוא הקים אז באמצעות פתרון צבע ללא תאיים. לאחר 2-5 דקות של הקלטה, לצבוע מוסר בעיקר מן הנוירון postsynaptic, המאפשר ויזואליזציה של Fluo-4-טעון boutons הסינפטי. טכניקה זו היה חלוץ ידי יה ואח' ^5.
5. צבען טעון boutons לאחר מכן ניתן דמיינו באמצעות הגדלה גבוהה, הצמצם גבוה אובייקטיבי המספרי עם מיקרוסקופ או מצלמה מבוססת או multiphoton. הקלטה סימולטני כל תא הדמיה סידן יכולה להיות מושגת באמצעות התקנה כפי שמוצג באיור 3. התמונות של הנוירון ועל boutons שמוצג באיור 2C נתפסו עם מכשיר מטען האלקטרון הכפלת יחד (EMCCD) המצלמה. כוחו של מקור האור עבור עירור נחלש ב -1.2% ל עם צפיפות ניטרלי 1.0 מסנן מסנן איריס מותאם פלט 12%. הארעיים סידן מן boutons presynaptic ירוק ניתן להבחין והקליט בזמן אמת, ומדד מקוון.

6. נציג תוצאות:

ספונטנית נוכחי הזרקת-עורר ירי של נוירונים Vibrodissociated

הקלטות מתוך טיפוסי vibrodissociated CA1 בהיפוקמפוס פירמידה נוירון מוצגים באיור 4 א. פעולה ספונטנית הפוטנציאלים להחטיא ניתן לצפות עצב פירמידליים ניתק מן החולדה basolateral האמיגדלה, ההיפוקמפוס VTA ^1,5. במהלך הנוכחי מהדק הקלטות CA1 עצב פירמידליים, hyperpolarizing הזרקת הנוכחי מייצר תגובות מתח טיפוסי בעוד זרמים depolarizing גודל מספיק לעורר פוטנציאל פעולה להחטיא עם דפוס ירי טיפוסי מתעכב עם רמות הזרם המתון והלא אדיב פוטנציאל פעולה בתגובה להזרקת זרם חזק ( איור 4 ב).

ספונטנית ו מיניאטורות זרמים GABAergic Postsynaptic מעכבות בנוירונים Vibrodissociated

במהלך מתח-clamp הקלטות עם פתרון CsCl מבוסס תאיים, זרמים סינפטיים ספונטנית הם נצפו (איור 5 א). אירועים אלה בוטלו בתמיסה המכילה סידן נמוכה ^2,6, וכן סוגי נוירונים ביותר חסומים לחלוטין על ידי GABA אנטגוניסטים לקולטן כגון bicuculline או gabazine (איור 5 ב ', ג'), המציין כי אלה sIPSCs בתיווך לשחרור הפעלה גאבא ו תת סוג של קולטן זה ionotropic. עם זאת, הנוירונים העיקריים של אזורים במוח כגון האמיגדלה basolateral ² ואזור tegmental הגחון ^5,7, GABA המצור קולטןמגלה EPSCs משך קצר יותר בתיווך glutamatergic ההפעלה של רצפטורים מסוג AMPA. מעניין לציין, כי היישום של TTX בריכוזים ספציפיים עבור המצור של רעלן רגיש ביותר מתח מגודרת תעלות נתרן מפחיתה את תדירות אמפליטודה של sIPSCs שנצפתה נוירונים vibrodissociated מאזורים שונים במוח (איור 6 א) ^2,4,7. לפיכך, ערוץ פעילות הנתרן משתתף לשחרר GABA ב צבט-off boutons הסינפטי. זה עדיין לא ברור אם במלוא מובן המילה פעולה פוטנציאלים נתרן מתרחשים מסופים אלה. ראוי לציין כי ההתנגדות של קלט היטב אטום 1 מיקרומטר מסוף בקוטר האקסון עשוי להיות גם לתחום GΩ. לכן, פתיחה של מספר קטן אפילו של תעלות נתרן עשוי להיות מספיק כדי depolarize מסופי להפעיל את ערוצי סידן כי לתווך הפרשת צימוד עירור. בנושא של הערוצים הללו סידן, הראיות עולה כי N ו - P / Q-סוג ערוצי להשתתף לשחרר במסופים GABAergic בהכנות vibrodissociated CA1 של ההיפוקמפוס ובמקומות אחרים ^8.

אפנון הפלסטיות של שידור על ידי מספר נוירוטרנסמיטורים לקולטנים נבדקה בעזרת נוירונים vibrodissociated ^3,4,9. נוירוטרנסמיטורים הראו modulatory פעולות כאלה אדנוזין, סרוטונין GABA, endocannabinoids, וכו ^{'2,6,10,11,12.} בנוסף, לטווח קצר הפלסטיות הסינפטית, כגון דיכוי שלילת קוטביות-Induced האנדוקנבינואידית תלויי של עיכוב (DSI) אף תוארה בהכנה זו ^2,11. ממצאים אלו מעידים כי צורות רבות של מתווכת קולטן טרנס הסינפטי איתות ידי neuromodulators אנדוגני הם שלמים בהכנת vibrodissociated.

סידן הארעית ואת שחרור שלפוחי במסופי אקסון בהכנת Vibrodissociated

באמצעות מיקרוסקופ המצויד EMCCD הפוך לתאר לעיל, בחנו הארעיים סידן מסופי presynaptic בהכנת נוירון-באוטון vibrodissociated. איור 2 מראה טעינה תא עם דילול Fluo-4 ובעקבות AM-esterified לצבוע postsynaptic ב נוירון CA1 בהיפוקמפוס פירמידה. הארעיים סידן ספונטנית הם נצפו בכמה צבע מלא boutons כפי שמוצג אזורים של עניין (ROIs) באיור 6B. יישום tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) מבטלת אלה הארעיים ספונטנית, המציין כי הם מתווכת על ידי הפעלת מתח מגודרת זרמי נתרן אשר מופעלים באופן ספונטני boutons, המוביל עולה סידן הבאים. הגדלת KCl תאיים מ 10 מ"מ על 40 מ"מ עם חילופי פתרון מהיר מייצרת גדל הקרינה, כפי שהיא נמדדת ROIs שמתאימים מסופי presynaptic (7 א 'איור). הקלטה סימולטני מן הנוירון postsynaptic משמש sIPSCs לפקח ולקבוע אם תדירות האירוע עלה שלילת קוטביות ⁺ K גבוה (איור 7 ב).

כדי להמחיש את היתוך שלפוחית ​​boutons presynaptic השתמשנו עכברים להביע synaptopHlourin לבנות בשליטת היזם Thy1 (שכותרתו spH21 עכברים). SynaptopHluorin ב לבנות המולקולרי שבו pHlourin מישור המילקה (מוטציה GFP עם רגישות משופרת pH) ¹² קשורה החלבון הקשור קרום שלפוחית ​​(VAMP2) ^13. הסדר זה ממקם את מוטיב pHlourin לומן שלפוחית ​​שבו הסביבה החומצית יחסית מרווה פלואורסצנטי. לאחר איחוי שלפוחית ​​מוטיב זה חשוף לסביבה תאיים נייטרלי יותר עם עלייה וכתוצאה מכך הקרינה בבית puncta שמתאימים שלפוחית ​​/ מסופי presynaptic. Vibrodissociation של נוירונים בהיפוקמפוס של עכברים spH21 מאפשר הדמיה של puncta ניאון גודל ומיקום הצפוי מסופי GABAergic (איור 8 א). יישום של high-K ⁺ - המכיל פתרון חיצוני מגדילה הקרינה במסופים אלה, אפקט זה נחסם בנוכחות פתרון חיצוני אשר סידן תאיים מצטמצם mM 0.2 (8B איור). לפיכך, עלייה שלילת קוטביות-Induced הקרינה נראה לשקף-עירור הפרשת צימוד ב סינפסות GABAergic כהכנה נוירון-באוטון.

היכולת למדוד הארעיים סידן presynaptic ואיחוי שלפוחית ​​במסופי האקסון של נוירון להכנת-באוטון מאפשר לנו לבחון את ההשפעות של neuromodulators, סמים של התעללות הפלסטיות הסינפטית על מנגנונים presynaptic מעורב צימוד עירור הפרשת ו-exocytosis / אנדוציטוזה. טכניקות אלה יכולים גם להיות משולב עם כלים מולקולריים אחרים מהונדסים גנטית עכברים לבחון את תפקידם של חלבונים מסוימים בתפקוד presynaptic ו אפנון / הפלסטיות.

באיור 1. נוירונים Vibrodissociated מאזור CA1 בהיפוקמפוס (א) התמונה של שמוזגו DICnd פלואורסצנטי ירוק תמונות GAD65 העכבר. תמונה DIC ממוזג עד מראים בבירור את מיקומם של מסופי ירוק (ב ') תמונה הקרינה מן עכבר synaptophluorin (spH21). בר סולם = 10 מיקרומטר

איור 2 מחוון טעינה הליך סידן: (א) כל תא הוא טעון עם צבע AM-esterified; (ב) כל תא הקלטה מדלל צבע; (C) מסופי הם דמיינו כמו אזורים של עניין (ראשי חץ)..

איור 3. תרשים סכמטי של הגדרת הניסוי עבור הקלטת כל תא בו זמנית הדמיה סידן מסופי presynaptic על נוירונים vibrodissociated. EMCCD = מטען האלקטרון הכפלת מצמידים המכשיר.

איור 4. הנציג גל מראה (א) פוטנציאל פעולה ספונטני מתוך vibrodissociated CA1 נוירון ו (ב) מתח התגובות הממברנה אל hyperpolarizing ו depolarizing זריקות הנוכחית מהדק הנוכחי הקלטות של נוירון CA1.

איור 5. (א) נציג של גל IPSCs ספונטנית מן הנוירון CA1 בצורת פירמידה. (BC) IPSCs נחסמו על ידי אחד gabazine (10 מיקרומטר; B) או bicuculline (20 מיקרומטר; C).

איור 6. TTX מעכב ספונטנית בשידור סינפטי GABAergic, ומונע הארעיים סידן presynaptic בהכנת בהיפוקמפוס vibrodissociated. (א) הקלטה של ​​נוירון vibrodissociated לפני ובמהלך יישום TTX. שים לב בתכיפותם משרעת של sIPSCs. (ב) הארעיים סידן שנצפתה מסוף Fluo-4-טעון presynaptic על נוירון vibrodissociated לפני ובמהלך יישום TTX. שים לב לאובדן מוחלט של הארעיים.

איור 7. סידן סימולטני אינדיקטור הדמיה הקלטה sIPSC כל תא מראה ההשפעות של K ⁺ גירוי גבוה. (א) הקרינה נמדדת לאורך זמן מתוך באוטון presynaptic עמוסה לצבוע Fluo, 04:00. (ב) להגדיל את תדירות סימולטני של משרעת sIPSC ובמהלך יישום גבוהה ⁺ K.

איור 8. Ca ^{2 +} תלויי גבוהה K ⁺ תגובה boutons presynaptic של נוירון spH21 פירמידה מאזור CA1 בהיפוקמפוס. (א) תמונה פלואורסצנטי של תא עצב vibrodissociated. (ב) High-K ⁺ היישום (מסומן על ידי פס שחור) הביאה לעלייה מתמשכת הקרינה בנוכחות פתרון תאיים הרגיל שלנו ⁺ המכילים Ca ^{2 (2} mM Ca2 ^+). עלייה לא הקרינה נצפתה ב Ca ^{2 +} תאי נמוך (0.2 מ"מ Ca ^{2 +).} הנתונים בגרף היו מנורמל מראש high-k ⁺ רמות הקרינה, ולהראות תגובה ממוצע של 3 boutons.

Discussion

Vibrodissociation מוצלח דורש כי פרוסות מכילים נוירונים בריא כי רווחים ביניים גמישים מספיק כדי לאפשר נוירונים כדי לצאת ללא נזק פרוסה רעילים. לכן, השיטה עובדת בצורה אופטימלית בגיל מוקדם לאחר הלידה (P1-21) כאשר פרוסות בריא יכול להתבצע עם חומר גליה פחות / interstiatial מאשר נמצא פרוסות המוח הבוגר. מניסיוננו, לעומת זאת, אופטימיזציה הכנה פרוסה להישרדות העצבית פרוסה עצמו עשוי להיות מועיל עבור הטכניקה vibrodissociation. הואיל ואנו שגרתי להכין פרוסות עבור הקלטה באתרו באמצעות aCSF שונה קר שבו סוכרוז כבר להחליף הרבה של תאי Na ⁺ ו - Ca ^{2 +,} פרוסות מוכן vibrodissociation יכול להיות מוכן (חתך למשל) ב aCSF הקלטה הרגיל שלנו. בעת הכנת פרוסות הקלטה מתא עצב בודדים את פרוסות עצמם יש לנו גם מקום פרוסות aCSF נורמלי ב 35 ° C רק לאחר חתך ולהשאיר אותם במשך 30-60 דקות בטמפרטורת זה לפני החזרה אותם לטמפרטורת החדר. עם זאת, פרוסות מוכן vibrodissociation מועברים מיד לטמפרטורת החדר מיד לאחר חיתוך. נהלים אלה לספק תשואה גבוהה יותר של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation, אולי בשל חוסר של רקמת חברת ביניים המאפשר נוירונים להיות מזועזע בקלות רבה יותר משוחרר מכל פרוסה עצמו. אנחנו לא בחנו ממצה הכנה התנאים פרוסה, כפי שאנו שגרתי להשיג נוירונים מספיק הקלטה שלנו ניסויים הדמיה ביום נתון. יתכן כי שינויים נוספים, כגון שינויים עובי פרוסת או נהלים preincubaton, יכול להיות עשוי להגדיל את התשואה של נוירונים בריא. טיפולים פרוטאז קלה מאוד נוסו במאמץ להגדיל את תפוקת התא ולקבל את הטכניקה לעבוד אצל בעלי חיים מבוגרים יותר. עם זאת, תמיד אפילו טיפול פרוטאז קלה נראה לשבש תפקוד הסינפסה. וכך, בעוד השילוב של פרוטאז מכני דיסוציאציה עדיין עשויים למצוא עבודה זה לא הוכיח אמין בנוירונים forebrain עד כה.

ראוי גם לציין את התשואה הנמוכה יחסית של נוירונים בריא לאחר vibrodissociation כלומר טכניקה זו שימושית בעיקר ללימוד תת נוירונים בשפע, בעיקר נוירונים ההקרנה. הזמינות של ה-GFP-לבטא בעכברים שבהם subpopulations עצבי קטן ניתן לזהות בקלות מגדיל את הסיכוי של לימוד נוירונים אלה נדירים. עם זאת, אם התשואה העצבית ניתן לשפר במידה ניכרת הצטברות של נתונים על הנוירונים האלה עשוי להיות איטי יחסית.

צעדים אחדים הוכיחו להיות מכריע עבור טעינת מוצלח של נוירונים עם סידן חישה צבעים. חשיפה לצבוע AM-esterified מבוצע על 37 ° C, ואנחנו לא הצליחו מנסה לצבוע עומס בטמפרטורות נמוכות יותר. ריכוז של צבעים צריך להיות מותאם בהתחשב הן זמן הטעינה והטמפרטורה מאז נראה כי ריכוז גבוה של העמסה, לצבוע מוריד ריכוז סידן boutons presynaptic. ראינו כי הטעינה עם ריכוזים גבוהים יותר מקטין את תדירות את המשרעת של sIPSCs. בעת טעינת סידן חישה צבעים לתוך מסופי presynaptic של נוירונים vibrodissociated, יש להקפיד כי קיבולת חציצה של boutons presynaptic קטן עשוי להיות שונה מזה של סומה ואת הגדלים של boutons אינן עקביות. Neuron המכילים מנות נשטפים עם פתרון HEPES שנאגרו חיצוני הטעינה הבאה, צבע, ואת זמן ההחלמה לאחר כביסה הוא קריטי. בנוסף, כדי להפוך את חותם טוב הקלטה שלם תאים, התאים יש לרחוץ ביסודיות להיפטר הלא הפנימו מולקולות צבען של קרום התא החיצוני.

בנוסף לשימוש נוירונים vibrodissociated הדמיה תא electrophysiology ולחיות, טכניקות immunocytochemical יכול להיות מיושם גם על תאים אלה ^11,12. תאים ניתן לתקן בקלות ומוכתמת עם מגוון רחב של נוגדנים, וסמנים תאים אחרים. השימוש בתאים אלה מספק הכנה נקי להדמיה של ביטוי החלבון מסופי presynaptic GABAergic. שימוש בעכברים המבטאים חלבוני ניאון בשליטת היזמים ספציפית נוירונים GABAergic מאפשרת לחוקר לזהות המסופים הסינפטיים הפרט בהכנת vibrodissociated (איור 1). סמנים הדמיה פלורסנט מסוג זה עשוי לאפשר מדידות מורפולוגיים באמצעות מסופים מבוססי לייזר מיקרוסקופיה וטכניקות חדשות יותר כמו STED (פליטה גירוי מיקרוסקופית דלדול). ויזואליזציה עם צבעים כי הדו"ח אופניים שלפוחית ​​סינפטית הוא גם אפשרי עם הכנה זו. Akaike ועמיתים לעבודה יש שכותרתו מסופי GABAergic עם צבע styryl, FM1-43 לדמיין מסופי בתאים חיים ^4.

זה צריך להיות גם ניתן לבצע תא בודד הפוכה transcriptase PCR ביטוי RNA פרופיל vibrodissociatedנוירונים. טכניקה זו מיושמת באופן שגרתי enzymatically-ניתק נוירונים נוירונים גדל בתרבות התא.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
פריט	חברה	קטלוג #	תגובות
רטט כלי פריסה רקמות	לייקה מיקרוסיסטמס	VT1200S
תרבית תאים תבשיל (35 מ"מ)	BD פלקון	353001
תחתית זכוכית מנות	Willco-צלחת	GWSB-5040-3522 או GWSB	0.16-0.19 מ"מ עובי זכוכית הדמיה
פיזואלקטריים Manipulator	Exfo-Burleigh	LSS-3000	אפשר גם להשתמש ממסר וכו '
SD9 כיכר דופק ממריץ	גראס טכנולוגיות	SD9K	מפעילה מניפולטור פיזואלקטריים
הביתור Stereoscope	Wild Heerbrugg	Typ 374590	אפשר גם להשתמש בכל stereoscope
Flaming / בראון micropipette חולץ	סאטר Instrument	P-97
קיר זכוכית דק נימים	העולם מכשירי דיוק	TW-150F-4	עבור להבה זכוכית אטום micropipette ו תיקון micropipette
ששת זלוף ערוץ שסתום בקרה	וורנר מכשירים	VC-6 או VC-6M
זלוף Fast-Step	וורנר מכשירים	SF-77B
מיקרוסקופ הפוך עם 20-63x יעדים	ניקון	TS200 Diaphot
EMCCD מצלמה	אנדור טכנולוגיה	iXon EM + DU-888
Excite תאורה פלואורסצנטי מקור האור	EXFO Photonics פתרונות בע"מ	X-Cite 120PC
Fluo-4, AM אינדיקטור סידן	מולקולרית בדיקות	F14201