בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

Summary

פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע חוזרות In vivo הדמיה בעמוד השדרה באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה מתואר. שיטה זו משלבת מכשיר ייצוב השדרה משטר ההרדמה כדי למזער את הנשימה הנגרמת תנועות להפיק נתונים הדמיה גלם הדורשים אין יישור או אחרים שלאחר עיבוד.

Abstract

בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה ¹ בעכברים שעברו הנדסה גנטית כדי לבטא חלבונים ניאון ^2-3 סוגים מסוימים תא הרחיבה באופן משמעותי את הידע שלנו על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברקמות רבים in vivo ^4-7. במחקרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), יש כבר יישום נרחב בתחום ההדמיה vivo במוח, אשר יצר שפע של הרומן ממצאים בלתי צפויים לעתים קרובות על התנהגותם של תאים כגון נוירונים, האסטרוציטים, microglia, תחת מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים ^8-17. עם זאת, סיבוכים טכניים בעיקר מוגבל ליישום בתחום ההדמיה vivo במחקרים של חוט השדרה עכבר חי. בפרט, הקרבה האנטומית של חוט השדרה אל הריאות והלב חפץ מייצר תנועה משמעותי שעושה הדמיה חוט השדרה חי משימה מאתגרת. פיתחנו שיטה חדשה אשר מתגבר על מגבלות מובנות של הדמיה בעמוד השדרה על ידי מייצב את עמוד השדרה, הפחתת הנשימה הנגרמת תנועות ובכך להקל את השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים לתמונה חוט השדרה עכבר in vivo. זו מושגת על ידי שילוב של מכשיר מותאם אישית ייצוב עמוד השדרה בשיטה של ​​הרדמה עמוקה, וכתוצאה מכך לירידה משמעותית של דרכי הנשימה הנגרמת תנועות. זה פרוטוקול הוידאו מראה כיצד לחשוף אזור קטן של חוט השדרה החיים שאפשר לקיים בתנאים פיסיולוגיים יציבה לאורך פרקי זמן ארוכים על ידי שמירה על פגיעה ברקמות ודימום למינימום. תמונות גולמיות נציג רכשה בפירוט vivo ברזולוציה גבוהה את הקשר ההדוק בין microglia ואת כלי הדם. רצף timelapse מראה את התנהגות דינמית של תהליכים microglial בחוט השדרה עכבר חי. יתר על כן, סריקה רציפה של אותו z מסגרת להפגיןשל יציבות יוצאת דופן, כי בשיטה זו ניתן להשיג לייצר ערימות של תמונות ו / או סרטים timelapse שאינן דורשות יישור התמונה שלאחר הרכישה. לבסוף, אנו מראים כיצד בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבקר ו Reimage באותו אזור של עמוד השדרה בבית timepoints מאוחר יותר, ומאפשר מחקרים ארוכי טווח של תהליכים פיזיולוגיים או פתולוגי מתמשך in vivo.

Protocol

1. מבנה המכשיר ייצוב עמוד השדרה

1. הצו STS-Narishige Clamps קומפקטי חוט השדרה MA-6N Narishige מחזיק מתאם ראש.
2. עיצוב מותאם אישית ולעשות צלחת נירוסטה בסיס פלדה להחזיק את שני חלקי Narishige יישור כך שהראש של החיה נתמכת תוך עמוד השדרה שלו וזנבו הם הידק. זכור כי המכשיר כולו צריך להתאים תחת עדשת המיקרוסקופ בדרך כלל על הבמה מיקרוסקופ הוריד.

2. בעלי חיים ניתוח

1. מחממים את החדר מיקרוסקופ עם מכשיר חימום אוויר ולתחזק אותו ב 37 ° C.
2. לשקול את החיה לעשות את לערבב חומר הרדמה באמצעות 100 מ"ג קטמין, 15 מ"ג ו xylazine acepromazine 2.5 מ"ג לכל ק"ג ממשקל הגוף, בדילול מלא בתמיסה NaCl 0.9% בתנאים סטריליים.
3. להרדים את החיה על ידי הזרקת חומר הרדמה תמהיל (KXA) intraperitoneally. צובט הבוהן רגיל יש לבצע על מנת להבטיח הרדמה עמוקה בכלאת הניסוי. מוסף עם מינון חצי שעה המקורי או לפי הצורך.
4. השתמש פנקס קטן לחימום החיה כדי לספק תמיכה תרמית תוך ביצוע הליך כירורגי.
5. החל מלאכותי משחה דמעות על העיניים על מנת למנוע התייבשות נזק הקרנית.
6. לגלח את החלק האחורי של החיה הראשונה עם מכשיר חיתוך ואז עם סכין חדה כדי להסיר לחלוטין את השיער מאזור סביב החתך.
7. הסרת שיער מגולח לחטא את פני העור מגולח עם כרית אלכוהול.
8. ביצוע חתך קטן (~ 1.5 ס"מ) האורך של העור מעל לרמה הרצויה השדרה (חוליות החזה המוצג כאן).
9. לחשוף את שרירי הגב על ידי retracting בעיון את רקמת חיבור תת עורית.
10. בזהירות להפריד את השרירים paravertebral מ עמוד השדרה ברמה הרצויה. ביצוע חתכים ספורות ביותר לנתק את השרירים משני הצדדים של כל תהליך spinous ואז לגרד את השרירים מנותקיםהדרך מפני השטח למינרית.
11. בחר את lamina כי יוסרו ולהכין את האתרים של כניסה עבור מהדק השדרה משני צדי עמוד השדרה, מקורי מיד הזנב כדי laminectomy. בזהירות את מקומו של רקמת השריר לבצע ארבעה כיסים שבהם מלחציים יתווסף.
12. הרם את עמוד השדרה עם קצה שיניים, מלקחיים ישר, כדי לאפשר הכנסה בטוחה של קצה קהה מספריים מעוקל תחת lamina בלי לגעת בחוט השדרה. בצע את laminectomy ידי לאט חיתוך העצם בצד אחד ולאחר מכן בצד השני.
13. השתמש מטלית כותנה או להכניס שנחתך מראש פוזרו חתיכות קטנות gelfoam נספגים ספוג הג'לטין לצד חתכים להגביל דימום מינורי. השתמש cauterizer כלי קטן כדי לשלוט דימום נוסף במידת הצורך. השתמש שחומם מראש נוזל סטרילי מלאכותי השדרה (ACSF) לשטוף רקמות.

3. ייצוב של עמוד השדרה הכנה עבור הדמיה in vivo

1. Plac דואר החיה על כרית הגבהה על צלחת הבסיס של המכשיר ייצוב השדרה לאבטח את ראש מתאם ראש מחזיק.
2. מקמו את מהדק השדרה של המכשיר STS-A בציר הקדמי, האחורי של החיה בתוך מוכנה מראש כיסים משני צדי laminectomy (איור 1). שני מלחציים צריך להיות ממוקם בזווית של 45 ° ~ יחסית לציר של החיה rostro-הזנב כדי לאפשר מספיק מקום להורדת עדשה טבילה במים על חוט השדרה חשוף (איור 1).
3. מקמו את מהדק השלישי של המכשיר STS-A בבסיס הזנב כך הגוף של בעל החיים יכול להיות תלוי באוויר לאחר הסרת כרית הגבהה למשך הניסויים הדמיה (איור 1).
4. בנה גם קטן Gelseal (Amersham Biosciences קורפ) סביב חוט השדרה חשוף כדי להקל על התחזוקה של חוט השדרה ב ACSF ואת טבילה של עדשת מיקרוסקופ בפתרון זה עבור הדמיה vivo.

jove_title "> 4. הדמיה vivo של חוט השדרה עם העכבר מיקרוסקופיה שני הפוטונים

1. מעבירים את החיה על המכשיר ייצוב עמוד השדרה בתוך החדר שחומם מראש המכסה את המיקרוסקופ לאבטח אותו על הבמה מיקרוסקופ הוריד הצבת laminectomy ישר תחת העדשה (איור 1).
2. תחתון עדשת מים טבילה בזהירות לתוך הפתרון ACSF לוודא שזה לא לגעת מלחציים השדרה או Gelseal.
3. השתמש epifluorescence לזהות את שטח של עניין ולהתמקד בו. מעבר למצב סריקת לייזר ולבצע הדמיה vivo באמצעות עירור מתאים שני פוטונים באורך גל לייזר, dichroics ו bandpass מסננים עבור fluorophores הנוכחי ברקמת הדמיה.

5. הדמיה חוזרות לאחר הניתוח טיפול

1. בסוף ניסויים הדמיה, להסיר את העכבר מהמכשיר ייצוב עמוד השדרה ובזהירות לנגב את Gelseal מאזור סביב laminectomy.נקו היטב את האזור.
2. שחזור תפר את שרירי הגב על laminectomy.
3. שחזור תפר את העור מעל laminectomy, ספוגית זה בבטאדין.
4. ספקו 1 Lactated מ"ל האצבעות פתרון (Baxter Healthcare) כתוסף תזונה ועל לחות, כמו גם טיפול משכך כאבים תת עורי (0.1 מ"ג / ק"ג עצירות).
5. ניהול intraperitoneally טיפול חיטוי (0.03 מ"ל לכל עכבר, 2.27% פתרון להזרקה enrofloxacin אנטיבקטריאלי).
6. מקום חיה על כרית חימום עד להחלמה מלאה מן ההרדמה ולאחר מכן בבית זה בנפרד.
7. חזור על הממשל חיטוי יומיומי של 3-5 הימים הראשונים לאחר הניתוח טיפול משכך כאבים כל 8-12 שעות במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח. צג בעל חיים יומיומי, כדי להבטיח התנהגות נורמלית להחלמה מלאה.
8. עבור הדמיה מחדש באמצעות laminectomy זאת, מחדש את העור והשרירים sutured וחזור על הפעולות המתוארות בסעיפים 2 - 4.
9. מחדש לאתר את previצילמו מבישה שטח באמצעות vasculature דם כמפה כפי שתואר לעיל ^10.

6. נציג תוצאות

הנהלים כל חיה בוצעו לפי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות השתמש באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו והם בהתאם לתקנות הפדרלי. תמונה של המכשיר ייצוב השדרה סכמטית המראה את המיקום של העכבר על המכשיר תחת עדשת המיקרוסקופ מוצג באיור 1. מתן מקום הולם תנועות נשימה מתחת לגוף של חיה מבטיח יציבות בתחום ההדמיה vivo בחוט השדרה. איור 2 מראה את הקשר ההדוק בין microglia ואת vasculature כפי שהיה הדמיה in vivo בחוט השדרה של Cx3cr1 ^{GFP / +} העכברים הטרנסגניים ^18, שבו microglia מסומנים endogenously עם GFP. איור 3 מציג דוגמאות חוזרותבתחום ההדמיה vivo כפי שהיא בוצעה על אותם אזורים בחוט השדרה אצל עכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי ב אקסונים השדרה (YFP-H שורה ³⁾ ו microglia (ב Cx3cr1 ^{GFP / +} העכברים).

באיור 1. ייצוב עמוד השדרה של העכבר בתחום ההדמיה vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. (א) מחוייט בסיס פלדה משמשת תמיכה ליישר את STS-מהדק קומפקטי Narishige חוט השדרה ואת MA-6N Narishige ראש מחזיק מתאם כפי שמוצג כאן. (ב) מיצוב נכון של העכברים הטרנסגניים מבוגר הרדים עם הרדמה KXA במכשיר ייצוב עמוד השדרה. הכנס מציג את המיקום של מלחציים השדרה מיד rostrally ו caudally כדי laminectomy לבין רקמת חוט השדרה חשוף.

באיור 2. הדמיה vivo של תאים צפיפות גבוהה microglial וכלי דם בחוט השדרה של עכברים בהרדמה. תחזית אך הבלתי מזדהות Z-ערימות של (A) צפופה מאוד GFP חיובי microglia (ירוק) בחוט השדרה של ^עכבר-GFP CX3CR1 ^{+ /} בסמיכות עם כלי הדם (אדום, בתווית עם הזרקה iv של rhodamine dextran). (ב) התמונה בהגדלה גבוהה שכותרתו כמו (A) של תא microglial יחיד המחובר לקיר של כלי דם עם תהליכים המורחבת סביב כלי וכלפי parenchyma חוט השדרה. סולם ברים, 10μm.

באיור 3. חוזרות בתחום ההדמיה vivo של מגזרים axonal אותו microglia כפי שהם הועברו ו reimaged בחוט השדרה של עכברים הרדים בימים שונים. (א) YFP-במעבדה אקסונים eled בימים 0 ו 5. (B). המבנים בכלי הדם והתאים אותו microglial סביבם הדמיה in vivo בחוט השדרה של Cx3cr1 ^{GFP /} עכברים ⁺ בימים 0 ו -1. סולם ברים, 10μm.

1. סרט נציג רצף timelapse רכשה in vivo מחוט השדרה העכבר. רצף זה מראה בסדר פרט דינמיקה תהליך microglial (ירוק) ואת האינטראקציות שלהם עם כלי הדם (אדום, בתווית עם iv הזרקת rhodamine dextran) לאורך זמן בתוך הרקמה מאוכלס בצפיפות עם מבנים ניאון. התמונות גלם תוקנו רק רעש הבהירות, הניגודיות הרקע הסרט timelapse נבנה על ידי Z-ערימות מקרין תמונה רכשה ברצף, ללא יישור התמונה, ממוצע או Z-מבחר של מטוסים בודדים. כלי דם עוברים מגוון דומה של מטוסים z כמו תמונות של microglia. Z עומק המטוס: 38 מיקרומטר.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

2. סרט רצף Timelapse הוכחת יציבות הגלם של שיטת הדמיה ברמה של מטוס-z אחת. רכישה מהירה של המטוס-z אותו יחיד בחוט השדרה של עכברים CX3CR1 ^{GFP / +} דגש על המכשיר ייצוב עמוד השדרה בהרדמה KXA, ממחיש תזוזה מינימלית בין מסגרות תמונה ברציפות בקצב סריקה של 1 מסגרת / s זה מהר יותר קצב הנשימה של העכבר. עקירה שיורית קטין כנראה בשל פעימות הלב. לחץ כאן כדי לראות את הסרט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשר יציבה חוזרות בתחום ההדמיה vivo של מבנים מאוכלסים בצפיפות הסלולר פלורסנט בחוט השדרה של עכברים הרדים באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. היציבות הושגה היא תוצאה של התקן מחוייט ייצוב השדרה משטר ההרדמה המפחיתה הנשימה הנגרמת חפץ בתנועה. המכש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1841	70 kDa, בדילול מלא ACSF (3% w / v)
קטמין HCl	Bionichepharma	NDC לא: 67457-001-10	בזריקות, 50mg/ml
Anased	לויד Labs	נדא לא: 139-236	Xylazine להזרקה, 20mg/ml
Acepromazine	Vedco	נדא לא: 117-531	בזריקות, 10mg/ml
דמעות מלאכותיות משחה	פניקס התרופות	NDC לא: 57319-760 - 25	חומר סיכה
בבטאדין	דיג	19-061617
מקפרסון, ווסטקוט מספרים	העולם Precision מכשירים	555500S	עקום, קצה קהה מספרים
סטרייט מלקחיים	העולם Precision מכשירים	555047FT	טיפ מלקחיים שיניים
כלי שיט קטנים לצרוב	המדע כלים פיין	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, פייזר	מיקסר מיל MM400
חוט השדרה קומפקט מלחציים	Narishige	STS-
ראש מחזיק מתאם	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences קורפ	80-6421-43
Lactated האצבעות	בקסטר בריאות	2B8609
Buprenex	Reckit בנקיזר פרמצבטיקה בע"מ	NDC לא: 12496 - 6757-1	עצירות, להזרקה
Baytril	באייר	נדא 140-913	Enrofloxacin, אנטיבקטריאלי להזרקה 2.27% (20ml)
כרית חימום - גדול	המדע כלים פיין	21060-10