Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

Summary

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Abstract

Multiplex PCR / קו הפוך כתם assay הכלאה מאפשרת זיהוי של עד 43 מטרות מולקולריות ב 43 דגימות באמצעות אחד ה-PCR זמנית תגובה ואחריו הכלאה בדיקה על קרום ניילון, אשר מחדש שמיש. בדיקות הן אמין "5 שונה על מנת לאפשר קיבוע על הממברנה. Primers הם ביוטין 5 "שונה המאפשר זיהוי של הכלאה מוצרים באמצעות PCR streptavidin-peroxidase ואת המצע chemiluminescent באמצעות סרט רגיש. עם ההתקנה עלויות נמוכות מתכלים, טכניקה זו היא זולה (כ 2 $ ארה"ב לפי המדגם), קצב העברת נתונים גבוה (ממברנות מרובים יכול להיות מעובד בו זמנית) ויש לו זמן תגובה קצר (כ 10 שעות).

הטכניקה ניתן להשתמש במספר דרכים. בדיקות מרובות ניתן נועד לזהות וריאציה רצף בתוך מוצר מוגבר אחד, או מספר רב של מוצרים יכול להיות מוגבר בעת ובעונה אחת, עם אחד (או יותר) בדיקות לגילוי שימוש לאחר מכן. השילוב של שתי הגישות יכול לשמש גם בתוך assay אחד. היכולת לכלול בדיקות מרובות רצף מטרה אחת עושה assay מאוד ספציפיות.

פורסם יישומים של mPCR / RLB כוללים זיהוי של גנים ^1,2 התנגדות לאנטיביוטיקה, הקלדה של סטפילוקוקוס עמידים-methicillin ^3-5 ו סלמונלה sp ^6, serotyping המולקולרי של Streptococcus pneumoniae ^7,8, סטרפטוקוקוס agalactiae ⁹ ו enteroviruses ^10,11, זיהוי של Mycobacterium sp ^12, זיהוי של המין ^13-15 ו - ¹⁶ בדרכי הנשימה ועוד ¹⁷ פתוגנים איתור וזיהוי של mollicutes ^18. עם זאת, את צדדיות של הטכניקה אמצעי יישומים בלתי מוגבלות כמעט ולא מוגבלת ניתוח מולקולרית של מיקרואורגניזמים.

חמשת השלבים mPCR / RLB הם פריימר) ועיצוב החללית, ב) מיצוי דנ"א הגברה PCR ג) הכנת הממברנה, ד) הכלאת זיהוי, ו-e) התחדשות של הממברנה.

Protocol

בחינה קפדנית חייב להינתן פריימר ועיצוב החללית. רצפים זמין כל היעדים של עניין ממסדי נתונים כגון GenBank צריך להיות מנוצל כדי לזהות אזורים שמורים אשר הם מטרות מתאימות. איפה מספר רב של מטרות נמצאים מוגבר ב assay mPCR יחיד, כל רצף מוגבר צריכה להיות באורך דומה, לא יעלה על 300 זוגות בסיסים, כדי למנוע תחרות. יישום החלופה של השיטה היא כדי להגביר עוד יעד אחד באמצעות primers נגד אזורים שימור להשתמש בדיקות מרובות כדי לזהות וריאציה רצף בתוך amplicon. במקרה זה, המוצר מוגבר PCR עשוי להיות ארוך יותר. הטמפרטורות פריימר חישול צריכים להיות דומים, עם תנאים PCR בהתאם. Primers המהווים מבנה משני חזקה או דימר פריימר יש להימנע. סיגמא אולדריץ DNA מחשבון ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) ניתן להשתמש כדי לנבא תכונות אלה.

בדיקות ה-DNA צריך להיות מתוכנן להיות חישול בטמפרטורה קרובה ל -60 ° C. כדי למקסם את סגוליות, שתי חלליות עבור מטרה כל העניין ניתן לכלול assay, אחד והכלאה על גדיל ה-DNA קדימה סמוך לאתר פריימר הפוך מחייב, והשני גדיל הפוכה סמוך לאתר פריימר קדימה מחייב. במקרה זה, הן primers קדימה חייבת להיות הפוכה ביוטין, שונה. אם רק אחד בדיקה לכל מטרה מוגבר נמצא בשימוש, אז רק אחד פריימר צריך להיות ביוטין שונה.

בעת תכנון primers ו בדיקות עבור assay mPCR / RLB מומלץ בחום להשתמש בשיטות סיליקו לחזות מוצרי ה-PCR ו הכלאה בדיקה כדי לתאם עם בתוצאות חוץ גופית. באופן אידיאלי זה נעשה באמצעות מבודד עבורו את רצף הגנום כולו זמין. תוכנות כגון FastPCR (זמין ב http://primerdigital.com/fastpcr.html) יכול לשמש למטרה זו. אות בדיקה חלש או נעדר ניתן לחזות היכן בניתוח סיליקו מציין זוג בסיס חוסר התאמה וכתוצאה מכך הטמפרטורות בדיקה נמוך חישול.

טכניקות DNA מיצוי ישתנו בהתאם דגימות נבדקות, ותנאי PCR יהיה תלוי בעיצוב פריימר. הקוראים מתייחסים לפרסומים על מבחני הפרט לקבל מידע נוסף לגבי מיצוי דנ"א ריאגנטים PCR ותנאי ^1-19.

Assay כל לרוץ עם בקרה נאותים כדי לספק לפחות אחת חיובית ואחת שלילית אות בדיקה עבור כל בדיקה על הממברנה, וכן דנ"א ללא שליטה. כמו כן הוא מועיל לכלול בדיקה בחלק העליון של קרום זה צפוי להיות חיובי עבור כל דגימות (למשל: מין או בדיקה ספציפית הסוג במקרה של מיקרו אורגניזם). בדיקה זו משמשת שליטה חיובית, אלא גם מאפשר התמצאות קלה של התוצאות.

1. הכנת ממברנה

1. הכן את הפתרונות הבאים:
   • 100 מ"ל NaHCO3 0.5m (pH 8.4)
   • 100 מ"ל NaHCO ₃ 0.5m
   • 20 מ"ל 16% EDAC
   • 250 מ"ל 0.1 M NaOH
   • 250 מ"ל 2xSSPE
   • 250 מ"ל SDS 2xSSPE/0.1% - מקום waterbath ב 60 ° C
   • 250 מ"ל 20 mM EDTA.
2. מחממים תנור ל 60 ° C.
3. נקו את Miniblotter Immunetics עם אתנול 70%.
4. לדלל את בדיקות oligonucleotide ב 0.5 M NaHCO ₃ עד ריכוז סופי של pmol 2 / μl ואת נפח של μl 200.
5. גזור קרום ניילון BiodyneC עד 15x15 ס"מ. בעזרת עיפרון שליט, כלל את חלל 0.5 ס"מ לרוחב החלק העליון של קרום ולכתוב פרטים כאן.
6. קרום חותם בתוך שקית ניילון עם 20 מ"ל טרי עשה פתרון EDAC 16% ו רוק בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
7. לשטוף במים deionised קרום למשך 30 שניות.
8. המקום קרום ב miniblotter עם ערוצי פועל על פני קרום (במקביל לקו עיפרון). שימי כרית תמיכה במקומו הסופג קרוב. לשאוב נוזל מתוך ערוצים.
9. מילוי נתיבים 1 ו 45 עם 150 μl 0.5 M NaHCO _3. השתמש 150 μl של כל פתרון בדיקה למלא נתיבי 2-44 ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. אם בועת אוויר מופיע בערוץ, שמירה על פיפטה במקום, במהירות לשאוב את הפתרון כדי לאפשר את בועת אוויר לצוף לראש פיפטה, ולאחר מכן נסה שוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
10. לשאוב פתרונות בדיקה, להסיר ולשטוף בתוך קרום 250 מ"ל 0.1 M NaOH בטמפרטורת החדר למשך 9 דקות.
11. לשטוף קרום ב 250 מ"ל 2xSSPE למשך 30 שניות.
12. לשטוף קרום ב 250 מ"ל מראש חימם SDS 2xSSPE/0.1% בתנור ב 60 ° C במשך 5 דקות.
13. אם לא בשימוש הכלאה מיד, לשטוף את הממברנה של 240 מ"ל 20 mM EDTA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות (שומר 10 מ"ל הנותרים), ואז לאטום קרום בתוך שקית פלסטיק עם שאר 10 מ"ל 20 mM EDTA ו storדואר במקרר ב 4 ° C.
14. לשטוף עם miniblotter Pyroneg חומר ניקוי במברשת. לשטוף ולאפשר לו להתייבש.

2. הכלאת איתור

1. הכן את הפתרונות הבאים:
   • 250 מ"ל SDS 2xSSPE/0.1% - חנות באמבט מים ב 60 ° C.
   • 500 מ"ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות באמבט מים ב 60 ° C
   • 500 מ"ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות בתנור ב 42 ° C
   • 500 מ"ל 2xSSPE - לשמור בטמפרטורת החדר
   • 500 מ"ל 1% SDS - חנות באמבט מים ב 60 ° C בתחילה (עבור שלב 3)
   • 250 מ"ל 20 mM EDTA - לאחסן בטמפרטורת החדר (עבור שלב 3).
2. הפעל את תנור אחד בכל 60 ° C ואחד תנור ל 42 ° C. מרתיחים את המים בכוס גדולה על פלטה חמה.
3. נקה Immunetics Miniblotter עם אתנול 70%.
4. Aliquot 10 מ"ל של SDS 2xSSPE/0.1% לתוך מיכל קטן. הוסף 20 μl של כל מוצר ה-PCR ל 150% SDS 2xSSPE/0.1 μl צינורות ספורים.
5. מרתיחים מוצרים PCR עבור 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס באמצעות בעלי קלקר. מניחים על קרח מיד לפחות 5 דקות.
6. לשטוף קרום הנותרים ב 240 מ"ל SDS 2xSSPE/0.1% ב 60 ° C בתנור במשך 5 דקות.
7. המקום קרום ב miniblotter עם כרית גיבוי. כדי להתמצא ערוצי לרוץ במאונך (בניצב קו עיפרון).
8. עודף יניקה נוזל ערוצי miniblotter.
9. הוסף הנותרים 150 SDS 2xSSPE/0.1% μl לערוצים הראשונה והאחרונה. הוסף מבושל מוצרים PCR לערוצים הנותרים (2-44) ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר.
10. המקום miniblotter שטוח 60 ° C בתנור במשך שעה 1 כדי לאפשר הכלאה להתקיים.
11. נוזל לשאוב מערוץ אחד ולאחר מכן להסיר קרום מן miniblotter.
12. לשטוף פעמיים prewarmed 250 מ"ל SDS 2xSSPE/0.5% בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
13. לחלח רשת ניילון עם הפרדה SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהשתמש בו כדי להפשיל הממברנה.
14. המקום מגולגל הממברנה לתוך צינור גלגלת, ואת לפרוש כדי להבטיח קרום abuts את פני השטח הפנימי. הוסף 3 μl המצומד streptavidin-peroxidase (Roche Applied Science) על 15 מ"ל SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהוסיף צינור הרים. בורג מכסה על בחוזקה דגירה בתנור רולר על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. ודא כיוון רול הוא כזה קרום לא להדק. בדוק מעת לעת דליפות.
15. לשטוף miniblotter ב Pyroneg דטרגנט ומים, לשטוף ולאפשר לו להתייבש.
16. הסרת קרום מהצינור הרים. לשטוף פעמיים הנותרים 2xSSPE/0.5% SDS על 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
17. לשטוף פעמיים 2xSSPE בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
18. הפעל את התנור עד 80 מעלות צלזיוס, במקום 1% SDS 500ml בתנור חם מראש.
19. מאפרים 15 מ"ל Amersham פתרון ECL זיהוי (7.5 מ"ל של תמיסת A ו 7.5 מ"ל של תמיסת B). בטל 2xSSPE ולהוסיף פתרון זיהוי. רוק בעדינות ביד במשך 2 דקות להבטיח כיסוי מלא של הממברנה עם פתרון. בטל פתרון chemiluminescent.
20. חותכים שתי יריעות של ניילון שקיפות כדי להתאים מחסנית חשיפה. המקום קרום בין שני סדינים במקום לתוך מחסנית חשיפה.
21. המשך אל החושך. תחת אור אדום, להוסיף סרט זיהוי ECL למחסנית ולחשוף במשך 5 דקות. כלב באוזן ימין בפינה התחתונה של הסרט עם הסרת לאפשר בכיוון הנכון בעת ​​הצפייה.
22. הסרט פתח עם מפתח אוטומטיות או אמבטיות כימיים כמו יצרן לכל הכיוונים.
23. חזור על החשיפה פעמים עם חשיפה ארוך או קצר אם נדרש.

3. התחדשות של ממברנה

1. לשטוף קרום 250 מ"ל ב SDS 1% ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות פעמיים.
2. לשטוף קרום 240 מ"ל ב 20 מ"מ EDTA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
3. חותם קרום בשקית פלסטיק עם 10 מ"ל 20 mM EDTA ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש מחדש בעתיד.

4. נציג תוצאות:

התוצאות הן הנצפים ביותר על ידי הצבת את הסרט על הרשת מודפס, או אחר סריקת תמונה וייבוא ​​לתוך התוכנה כגון BioNumerics (יישומי מתמטיקה, Sint-מרטנס-Latem, בלגיה). התוצאה בכל בדיקה יש לפרש תוך התייחסות בדיקות בקרה חיוביים ושליליים. התוצאות מדורגות כמיטב שלילי או חיובי חלש. תוצאות חיוביות שבו האות חזק כמו או יותר חזק לחקור את השליטה חיובית. תוצאות שליליות הן שם האות נעדר או שווה לשלוט השלילי (במקרה של אות הרקע). תוצאות חלשות הם שבו האות חלש יותר מאשר לחקור את השליטה חיובי, אבל חזק יותר שליטה שלילית. תוצאות חלש עשוי להיות תוצאה של מוטציות נקודה המוביל מחייב בדיקה חלש, או בשל אי - ספציפי אותות היווצרות dimer פריימר. באמצעות שתי בדיקות לכל יעד הריבית יכולה לשפר את הספציפיות, שם תוצאה חלשה יחיד יכול בבטחה להתפרש האות הלא ספציפית. אם נותר ספק כלשהו, ​​תגובה אחת Plex PCR ניתן לבצע עם זיהוי הג'ל מבוסס רצף של המגבר כלlified מוצר כדי לקבוע אם התוצאה היא חיובית באמת. התוצאה נציג מוצג באיור 2.

1. איור mPCR / RLB עקרונות (P1) שלב 1.9. אמין בדיקות שונה קשורים קוולנטית אל קרום ניילון. (P2) שלב 2.10. ביוטין שונה מוצרים PCR הם הכלאה של בדיקות. (P3) שלב 2.14. Streptavidin, שכותרתו עם peroxidase, הוא מודגרות עם הקרום ונקשר ביוטין. (P4) שלבים 2.19-2.21. Peroxidase catalyses תגובה של ריאגנטים זיהוי ECL, ייצור אור שבה הסרט רגיש לאור חשוף. הממברנה נשטף אז לשימוש חוזר.

איור 2. MPCR נציג / RLB התוצאה. דוגמאות 1 עד 6 לייצג שולטת חיובית - ביניהם יש אחד לפחות אות בדיקה חיובית עבור כל אחד 43 בדיקות. כל רצף היעד (באמצעות U) מזוהה עם שתי בדיקות שונות על מנת למקסם את סגוליות. בדיקות A1 ו-A2 לייצג מינים ספציפיים בדיקות אשר צפויים להיות חיוביים עבור כל דגימה ולסייע עם המכוונת את הסרט. בדיקה A1 חוזר בחלק התחתון של הממברנה. דוגמאות 7 ו -8 הם שולטת שלילית. שים לב, בדיקות Q1, Q2, T1 ו-T2 יש אות שולטת שלילי, המעיד על הכריכה ספציפי סביר של primers או דימר המוצר פריימר. עיצוב מחדש של אלו בדיקות או primers יהיה צורך. בדיקות C1, D1 ולהראות F1 נמרח על פני קרום הנראה בשל ספיגת הלא ספציפית כמה המצומד streptavidin-peroxidase או המצע chemiluminescent, אולם זה נכון להבחין בקלות בין אותות בדיקה חיובית. בדיקות D1 ו-D2 יש אות חלש יחסית לעומת בדיקות אחרות, זה יכול להיות בגלל amplicons גדול המוביל הגברה פחות יעיל. בדיקה J2 הוא שלילי הוא מספר דוגמאות (1, 3, 4, 6, 39) שבו חללית J1 היא חיובית. זה ככל הנראה מייצג מוטציה מחייב האתר J2 עבור דגימות אלה.

Discussion

השיטה mPCR / RLB היתרי זיהוי סימולטני של מספר רב של amplicons PCR. בשל הרגישות הגבוהה של בדיקה לגילוי מבוססי chemiluminescent, זמנית יחיד PCR תגובה עם מספר גדול של זוגות פריימר יכול לשמש כדי להגביר את תבנית ה-DNA.

אם לא מתקבלים אותות בדיקה עם אחד או יותר דגימות, ביצוע אלקטרופורזה בג'ל עם מוצר ה-PCR הנותרים יכולה לסייע להבחין אם הבעיה היא עם הגברה PCR או הכלאה בדיקה. איפה כל אותות בדיקה על הממברנה חלשים או נעדרים, אבל ג'ל אלקטרופורזה מציין מוצלח הגברה PCR, האפשרויות כוללות בעיות עם תיוג של הממברנה, התחדשות שגוי של קרום לאחר השימוש הקודם, טמפרטורות נכונות במהלך הדגירה הכלאה או streptavidin, או פגום streptavidin- peroxidase המצומד או מגיב לגילוי.

אם דגימות בקרת עולה כי בדיקות בודדים ניתן לייצר אותות שלילי כוזב, PCR יחיד עם זיהוי הג'ל מבוסס רצף הבאות ניתן לבצע כדי לוודא הגברה של מוצר ה-PCR ולחפש וריאציה רצף באתר מחייב בדיקה. אות בדיקה חלש או נעדר יכול להיות בגלל גודל amplicon גדול: אם אפשר amplicons כל צריך להיות באורך דומה פחות מ -300 נ"ב. מבנה ה-DNA משני של amplicons יכול גם לייצר מחייב בדיקה עני, ועלול להצריך עיצוב מחדש של ספרי לימוד. פריימר בודדת או ריכוזי בדיקה עשוי גם להיות מגוונות כדי לייעל את עוצמת האות.

אותות חיוביים False בשל מחייב בדיקה של primers nonamplified או פריימר-dimer המוצר יכול להיחקר על ידי ביצוע PCR יחיד עם זיהוי הג'ל מבוסס רצף הבאים. במקרה זה, עיצוב מחדש של בדיקות ניתן חייבה. מוטציות נקודתיות באתרים מחייב בדיקה עלולה להוביל אותות חלשים או נעדרים. מתן שתי בדיקות עבור כל מוצר מוגבר עושה את זה קל לזהות. מאפיין זה עשוי להיות מנוצל עם פריימר זהיר ועיצוב בדיקה כדי לזהות שינויים קטנים ב-DNA רצף היעד.

לסיכום, בעוד ישנן שיטות רבות של זיהוי המוצר הבא תגובה זמנית PCR זמין, mPCR / RLB יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה וזול, עם עלויות התקנה נמוכות. הגמישות של השיטה היתרי השימוש בו למגוון רחב של יישומים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
אמין 5 "C6 שונה בדיקות oligonucleotide	סיגמא אולדריץ
NaHCO 3	סיגמא אולדריץ	S-8875	0.5 פתרון M עשה עד pH 8.4
NaOH	סיגמא אולדריץ	S5881	0.1M פתרון
20xSSPE חיץ	Amresco	0810-4L
Dodecyl נתרן סולפט (SDS)	סיגמא אולדריץ	L-4390	להמציא פתרון המניה 10%, לא החיטוי, יש לשמור על מקסימום 1 שבוע לפני השימוש
Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)	סיגמא אולדריץ	E9884	מאפרים 0.5 פתרון M מותאם pH 8.0 ו החיטוי
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N 'ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDAC)	סיגמא אולדריץ	E7750	להמציא פתרון 20 מ"ל 16% רק לפני השימוש באמצעות EDAC 3.2 גרם ו 18 מ"ל מים Millipore
BiodyneC ניילון 0.45 מיקרומטר ממברנה 20x20 ס"מ	מל מדעי החיים	74480C
Deionised, מים מטוהרים
Pyroneg נוזלי ניקוי	ג'ונסון Diversey	HH12291
Streptavidin-peroxidase המצומד	רוש	11 089 153 001
Amersham ECL זיהוי ריאגנטים	GE Healthcare	RPN2105
Amersham ECL זיהוי ריאגנטים	GE Healthcare	RPN2105
מטולשקפים הסרט שקיפות	חברות אקספרס	504 EXP מטולשקפים
Amersham hyperfilm ECL ביצועים גבוהים chemiluminescent הסרט 18x24 ס"מ	GE Healthcare	28906837
קרח

ציוד	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Shake'n'Stack תנורים Hybaid (2) בקבוק מתגלגל רשת ניילון המפריד	Thermo Scientific	HBSNSRS220	השיטה יכול להתבצע עם תנור אחד, כל עוד יש מתקן לשמירה על פתרונות 42 ° C ו 60 ° C לפני השימוש
רקדנית הבטן נדנדה פלטפורמה	Stovall מדעי החיים	יורו BDbo
Miniblotter	Immunetics	MN100-45
המים באמבטיה
יניקה
חם בצלחת
חשיפה מחסנית	סיגמא אולדריץ	Z36 ,009-0
רנטגן הסרט מפתח			ניתן גם להשתמש, מפתחת מתקן מים במגשי בחדר חשוך במקום אוטומטיותמפתח. Lumino-imager עשוי לשמש גם במקום הסרט Xray