הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Summary

תאים דנדריטים ספיגת אנטיגנים ולנדוד אל האיברים החיסונית להציג אנטיגנים לתאי T מעובד. Qdot ננו תיוג מספק אות ניאון ארוכת טווח ויציבה. זה מאפשר מעקב של תאים דנדריטים לאיברים שונים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

תאים דנדריטים (DCS) הם תאים אנטיגן מקצועי המציג (נגמ"שים) נמצא ברקמות הפריפריה באיברים החיסון כגון בלוטת התימוס, מח העצם, הטחול, בלוטות הלימפה וטלאים של Peyer ^1-3. DCs נוכח היקפי מדגם רקמות האורגניזם נוכחות של אנטיגנים, אשר הם תופסים, תהליך נוכח פני השטח שלהם בהקשר של מולקולות histocompatibility הגדולות (MHC). ואז, אנטיגן טעון DCs לנדוד לאיברים החיסונית שבו הם מציגים את אנטיגן מעובד על לימפוציטים מסוג T מפעילה תגובות חיסוניות ספציפיות. אחת הדרכים להעריך את יכולות הנדידה של DCs היא תווית אותם עם צבעי ניאון ^4.

בזאת אנו מדגימים את השימוש nanocrystals ניאון Qdot לתייג מח עצם הנגזרות Murine DC. היתרון של תיוג זה הוא Qdot nanocrystals בעלי הקרינה יציב וארוך טווח ההופכים אותם אידיאליים לאיתור תאים ברקמות שכותרתו התאושש. כדי להשיג זאת, התאים הראשונים יהיה התאושש קישואים עצם Murine ותרבותי עבור 8 ימים בנוכחות גורם macrophage-מושבה granulocyte מגרה כדי להשרות התמיינות DC. תאים אלה יתויגו בתור מכן על ידי קצרה הדגירה במבחנה עם Qdots ניאון. תאים ויטראז ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים יהיה ניתן להזריק לתוך חיות הניסוי בשלב זה או יכול להיות לתאים בוגרים של דגירה על במבחנה עם גירוי דלקתי. בידיים שלנו, התבגרות DC לא לקבוע אובדן אות ניאון ואינו מכתים Qdot משפיעים על תכונות ביולוגיות של DCs. לאחר ההזרקה, התאים האלה יכולים להיות מזוהים באיברים החיסונית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבאים לנתיחה טיפוסי ונהלים קיבעון.

Protocol

1. Dissection עצמות הירך העכבר tibiae והתרבות של תאים במח העצם

1. הקורבן 2 עכברים בחנק CO ₂ ובזהירות לנתח tibias ואת עצמות הירך ללא חיתוך קצות העצם.
2. נקו את העצמות מכל הרקמות המצורף על ידי שימוש בנייר טישו. היזהר שלא לשבור את העצמות.
3. לעקר את העצמות על ידי טבילה באתנול 70% עבור 10 דקות בצלחת פטרי 35 מ"מ. מרגע זה, לעבוד בתוך ברדס biosafety כדי למנוע זיהום של תרביות תאים.
4. שחזר את העצמות מן אתנול ולתת להם אוויר יבש 5 דקות בצלחת פטרי בתוך ארון biosafety.
5. חותכים את עצמות הירך לשניים, ואת עצם השוק על ידי קצה הדק שלה. להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 1 מ"ל של מדיום RPMI (ללא בסרום אך עם אנטיביוטיקה) באמצעות מזרק סטרילי על צלחת פטרי סטרילית.
6. ההשעיה התא נאספים ורחץ 2X במדיום RPMI ידי צנטריפוגה 10 דקות ב צינור 15 צנטריפוגות מ"ל ב 1100 סל"ד בצנטריפוגה קירור (4 ° C) עם הרוטור דלי מתנדנד.
7. לאחר לשטוף האחרון, resuspend התאים מ"ל 2 של חיץ תמוגה ACK ו דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסל כדוריות דם אדומות.
8. הוסף 13 מ"ל של RPMI עם 10% FBS, resuspend ולשטוף 2X במדיום הזה עם אותן הגדרות כפי שמתואר 1.6.
9. ספירת תאים, להסתגל 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל עם RPMI 10% FBS, ולהוסיף rm-GM-CSF (20 ng / ml הריכוז הסופי) ^5.
10. הוסף 10 מ"ל של השעיה זו איכות, סטרילי מיקרוביולוגית, צלחת פטרי 10 ס"מ, והתרבות ₂ CO אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).
11. שלושה ימים לאחר מכן, להוסיף עוד 10 מ"ל של RPMI 10% FBS עם 20 ng / l של rmGM-CSF לכל אחד צלחות מוכן.
12. שלושה ימים לאחר מכן 10 מ"ל של השעיה סלולריים הם התאושש מנה פטרי, centrifuged כמו 1.6, resuspended בהיקף זהה של 10% RPMI FBS עם rmGM-CSF וחזר צלחת פטרי. בתרבית תאים הם עבור 2 ימים נוספים של CO ₂ באינקובטור.

2. אוסף וסימון של DCs

1. לאחר 8 ימים בתרבית תאים חסיד רופף הם התאוששו על ידי שטיפת צלחות פטרי עם מדיום חדש. פרוטוקול זה הופך סביב 2-4 x10 ⁸ DCs בידינו. תאים ניתן לנתח עבור פנוטיפ DC ידי cytometry הזרימה.
2. תאים שנאספו מסומנים אז עם קיט 655 Qtracker תיוג Cell בהחלט הבאים הוראות היצרן.
3. יש לנו תוצאות מצוינות תיוג מח עצם הנגזרות Murine DCs עם Qdots בריכוז 10 ננומטר. כדי להשיג זאת, aliquots של תא Qtracker רכיבים תיוג Kit A ו-B מעורבים בכמויות שוות, מודגרות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, וכן בדילול מלא מיד 1 / 100 בינוני טרי עם vortexing עבור 30 s.
4. כדי להכתים 5 x 10 ⁶ DCs, לערבב 5 μl של כל הרכיבים בערכה A ו-B בצינור Eppendorf ו דגירה של 5 דקות על טמפ החדר. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של דגירה RPMI FBS 10%, ו מערבולת לשנייה 30.
5. הוסף 0.5 מ"ל של השעיה התא המכיל 5 ⁶ DCs x10 ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
6. לאחר מכן, לשטוף תאים 2X ב RPMI 10% FBS (1,100 סל"ד). תאים יכולים להיות resuspended ב RPMI לתרבות נוספת או PBS להזרקה בעכברים ניסיוני.

3. הערכת DC שכותרתו

1. תיוג Cell ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להשיג זאת, ירידה של השעיה תא מתווסף המיקרוסקופ שקופית, מכוסה coverslip זכוכית, ומוערכת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לקחת בחשבון כי Qdots אלה פליטת ספקטרום עירור של 565nm-525nm ו - 405 בהתאמה (איור 3 )
2. בשלב זה, התאים שכותרתו ניתן להזריק בעלי חיים, או התבגרות יכול להיגרם על ידי דוגרים תאים אלה במשך 48 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5 CO ₂₎ בנוכחות LPS (100 ng / ml) ו-TNF ( 20 ng / ml). תיוג פלורסנט אינו מושפע התבגרות DC (איור 4).

4. נציג תוצאות:

בזאת אנו תיאר כיצד להכין מח עצם הנגזרות Murine DCs ואיך שכותרתו אותם עם Qdots ניאון. איור. 1 מסכמת את ההליך כדי לקבל את התא, בעוד איור. 2 מתאר את הליך לתייג אותם עם Qdots. כפי שמוצג באיור. 3, כמעט כל התאים מסומנים על ידי הליך זה, והדבר אינו מושפע התבגרות DC עם גורמים דלקתיים (איור 4). איור. 5 מראה כי Qdot מוכתם DCs (Fig.5a) להתנהג בדומה הלא מוכתם תאים כאשר טופלו עם קוקטייל דלקתית. שתי ההכנות תא דומה upregulate ביטוי של מולקולות costimulatory (איור 5 ב); לייצר כמויות דומות של IL-6 (איור 5c) ו תחמוצת החנקן (איור 5d) על גירויים התבגרות. זה מסכים עם previהנתונים שפורסמו המפוקפקת המציין כי מכתים Qdot אינו משפיע על היכולת של DC להפוך תאים בוגרים מסוגלים לעורר תגובות חיסוניות [6]. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש להזרקת חיות הניסוי. כפי שמוצג באיור. 6, 2 ימים לאחר הזרקה תוך ורידית של DCs שכותרתו לעכברים, הצלחנו לזהות Qdot מוכתמת תאים בטחול. זהו גם הסכם עם הנתונים שפורסמו הקודם מראה את השימוש של nanocrystals Qdot להעריך ההגירה של DC in vivo [6] על ידי הדמיה לא פולשנית ו cytometry הזרימה.

1. תרשים זרימה תרשים של הדור DC ממח העצם. בזאת אנו מתארים את תהליך השגת מוח העצם הנגזרות DC. שני tibias ואת עצמות הירך הם גזור ונקי מן הרקמה הסובבת. טיפים העצם נשמרים הפנימי של העצמות הן סמוקות בינוני. לאחר ביטול כדוריות דם אדומות, תאים במח העצם הם מתורבתים במשך 8 ימים בנוכחות GM-CSF כדי לבדל אותם DCs.

2. איור תרשים זרימה של תהליך התיוג. Aliquots שוויון של תא Qtracker רכיבים תיוג Kit A ו-B מעורבבים בצינור Eppendorf. התאים הדנדריטים הם שנאספו 8 יום מח עצם תרבויות עם GM-CSF ו מעורבב עם צבע את התוויות עבור 60 דקות ב 37C. ואז התאים נשטפים בתקשורת לחסל חלקיקים תיוג עודף.

איור 3. Microphotography פלורסנט של DCs מיד לאחר תיוג. ירידה של תאים שכותרתו הופקד בשקופית זכוכית מכוסה על ידי coverslip. ואז, דגימות הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונות נרכשו באמצעות מצלמה דיגיטלית 5.0 Micropublisher CCD צבע (Qimaging, Surrey, BC קנדה).

איור 4. Microphotography פלורסנט של DCs לאחר ההבשלה h 48 במבחנה. DCs תווית היו בתרבית במשך 48 שעות עם LPS (100 ng / ml) ו - TNF-α (20 ng / ml) בשקופיות זכוכית על ₂ CO אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2). ואז, דגימות נשטפו עם PBS (5 דקות, 2X), קבוע עם אצטון (15 דקות, 4 ° C) counterstained עם DAPI. תאים הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעיל.

איור 5. פעילות ביולוגית של Qdot DCs בוגרת מוכתם. DCs תווית התבגר במבחנה לעיל נותחו על ידי cytometry זרימה (א) ו - (ב). (א) Qdot מוכתמת תאים לתת איתות חזק בערוץ FL3 (PercP). מוצלל היסטוגרמה: שליטה בלא כתם. (ב) DCs Qdot מוכתמת בלא כתם היו מוכתמים בנוסף עם נוגדנים ספציפיים כנגד סמנים התבגרות CD86 ו CD40, בקרות אלוטיפ. תאים נותחו אז cytometer זרימה FACSort (בקטון דיקינסון, בסן חוזה, קליפורניה). בנוסף, IL-6 (ג) ו - תחמוצת החנקן (NO) נקבעו supernatants של Qdot מוכתם DCs בוגרת שולטת. רמות IL-6 ו - תחמוצת החנקן נקבעו באמצעות ניתוח ELISA ו assay Griess כפי שתיארנו בעבר ^{7, 8.} כל הנתונים הראו בנתון זה הוא נציג של שניים או שלושה ניסויים בלתי תלויים מראים תוצאות דומות. הנתונים נותחו על ידי ANOVA באמצעות תוכנת GraphPad.

איור 6. גילוי DCs שכותרתו ברקמות גזור. DCs בוגרת תווית (1x10 ⁶ תאים) הוזרקו לעכברים לווריד C57BL / 6. (א) יומיים לאחר מכן העכברים הוקרבו ו spleens שנאספו, הצמד קפוא, מוטבע אוקטובר, ו - 8 חלקים מיקרומטר מוכן באמצעות cryostat. ואז, דגימות תוקנו עם אצטון (15 דקות, 4 ° C) counterstained עם DAPI. תאים הוערכו ב מיקרוסקופ פלואורסצנטי לעיל איור 6 א:. בהגדלה 40X, איור 6 ב: בהגדלה 100x, איור. 6C, 400X ההגדלה.

Discussion

Murine מיאלואידית) DCs נעשה שימוש נרחב על מנת לקבוע את היעילות ושיפור DC מבוסס חיסונים; לחקור DC: אינטראקציות תא T או פיתוח DC וכן לקבוע את תפקידם במחלות שונות ^9-11. בזה אנו מראים כיצד ליצור DCs מ מבשרי התאושש קישואים עצם tibias ואת עצמות הירך. אנו לשחזר את העצמות ללא חיתוך טיפים, ומאפשר לנו לעקר אותם על ידי טבילה באתנול 70%, ובכך להקטין את ההסתברות של זיהום. כדי לבדל את DCs מתאי מוח העצם אנו משתמשים רק GM-CSF כפי שתואר קודם לכן ^5. אף על פי פרוטוקולים מסוימים להשתמש גם IL-4, זה כבר דווח כי ציטוקין זה אינו הכרחי כאשר עובדים עם רמות גבוהות של GM-CSF ^12. ואכן, אנו הוכיחו בעבר כי DCs הללו מסוגלים לגרום התגובה החיסונית ^13. כמו כן, הטיפול חייב להילקח להתאושש התאים רק חסיד רופף בין 8 ימים תרבויות על ידי שטיפת צלחות פטרי עם המדיום מאז תאים המצורפת מראים פנוטיפ יותר מונוציטים דמוי. כאן אנחנו מראים את התיוג של DCs עם חלקיקים Qdot ניאון. תיוג זה יש כמה יתרונות ביחס לשיטות אחרות. ראשית, חלקיקים Qdots משולבים בקלות לתוך התאים. שנית, אות ניאון הוא גבוה מאוד ולא משתנה על ידי התבגרות DC. שלישית, הקרינה לא הולך לאיבוד כאשר תאים או רקמות קבועים עם ממסים כגון אצטון, בניגוד למה קורה אם ה-GFP משמש תג DCs ^14, מתן גמישות רבה יותר בכל רגע לבחור פרוטוקולים מכתים. לבסוף, את האות ניאון גבוהה שניתן על ידי חלקיקים אלה מאפשר הדמיה של רקמות התאים למרות אוטומטי פלואורסצנטי. כפי שתואר קודם לכן ^6, מכתים Qdot לא השפיע על יכולת התבגרות של תאים אלה. בזה אנו מראים כי Qdot מוכתם DCs להתנהג בצורה דומה לזו של הלא מוכתם DCs, upregulating מולקולות costimulatory, והפקת IL-6 ו - תחמוצת החנקן בתגובה לגירויים דלקתיים. למרות DCs הם תאים מיוחדים המעוררים תגובות חיסוניות, הם הוכחו להשתתף במצבים פתולוגיים כגון סרטן, טרשת עורקים ^{4, 15, 16.} הם כבר טענו גם להשתתף בתהליך angiogenic ^{17, 18,} ​​הציע גם מבחינה מבנית השתתפות בפיתוח של כלי חדש ^{19, 20.} לכן, שיטות המאפשרות מעקב DC in vivo, וקביעת לוקליזציה הגיאוגרפי שלהם ברקמות שונות ^{4, 21, 22} יקר מאוד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
C57BL / 6 עכברים	ג'קסון מעבדות		נקבות, 6-8 שבועות
RPMI	Invitrogen	11875-119
בסרום שור עוברית, מוסמך	Invitrogen	10437-028
לאנטיביוטיקה antimycotic	Invitrogen	15240-096
PBS	Invitrogen	10010-049
Lysing ACK הצפת	Lonza Walkersville, Inc	10-548E
רקומביננטי Murine GM-CSF	PeproTech Inc	315-03
655 Qtracker Cell תיוג Kit	Invitrogen	Q25021MP
Lipopolysaccharide	Invivogen	tlrl-eblps
רקומביננטי Murine TNF אלפא	Peprotech	315-01A
נוגדן CD86	BD Biosciences	553691
נוגדן CD40	BD Biosciences	553791
מגיב Griess מערכת	Promega	G2930
IL-6 ללכוד נוגדן	eBioscience	13-7061-81
IL-6 זיהוי הנוגדן	eBioscience	13-7062-81