ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Summary

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט ( Tc טרט) ואת הכינון מחדש של פעיל ט castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP) מורכב במבחנה.

Abstract

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט (Tc טרט) ואת הכינון מחדש של ט פעיל ribonucleoprotein castaneum telomerase (RNP) מורכב במבחנה.

Telomerase הוא transcriptase הפוכה התמחה ¹ המוסיפה חוזר דנ"א קצרים, נקרא הטלומרים, עד הסוף '3 ​​של כרומוזומים ליניארית ² המשמשים כדי להגן עליהם מפני היתוך end-to-end והשפלה. בעקבות שכפול הדנ"א, קטע קצר הוא איבד בסוף כרומוזום ³ וללא telomerase, התאים ממשיכים להתחלק עד שבסופו של דבר להגיע הגבלת Hayflick שלהם ^4. בנוסף, telomerase הוא רדום ברוב התאים הסומטיים ⁵ אצל מבוגרים, אך היא פעילה ⁶ תאים סרטניים בהם הוא מקדם את אלמוות תא ^7.

האנזים telomerase מינימלי מורכבת משני רכיבי הליבה: למקטע החלבון (טרט), אשר כוללת את למקטע הקטליטי של האנזים ואת מרכיב בלתי נפרד RNA (TER), אשר מכיל את תבנית משתמש טרט לסנתז הטלומרים ^8,9. לפני 2008, רק מבנים בודדים לתחומים telomerase נפתרו ^10,11. פריצת דרך משמעותית בתחום זה בא קביעת המבנה הגבישי של ¹² הפעיל, למקטע הקטליטית של ט ' telomerase castaneum, Tc טרט ^1.

כאן, אנו מציגים שיטות להפקת כמויות גדולות של טרט פעיל, Tc מסיסים ללימודי מבניים ביוכימיים, ואת הכינון מחדש של המתחם telomerase RNP במבחנה עבור מבחני פעילות הטלומרז. סקירה של שיטות ניסיוניות בשימוש מוצג באיור 1.

Protocol

1. ביטוי רקומביננטי טרט Tc

1. לחסן 6 L של 2YT התקשורת (6 x 2 L נבוך צלוחיות Erlenmeyer המכיל 1 ליטר של מרק 2YT בכל אחד) מתוך שש צלחות טריים של תאים pLysS הפך רוזטה (DE3) המכיל את סינתטיים Tc טרט פלסמיד עם TeV N-מסוף cleavable hexahistidine- תג.
2. התאים לגדול ב 37 ° C תוך רועד בסל"ד 220 עד ₆₀₀ OD של 0.5-0.6.
3. להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ"מ.
4. הפחת את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, איטי רועד עד 150 סל"ד, ולאפשר לתאים לבטא חלבון 4-5 ח
5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C ו - 3500 סל"ד למשך 30 דקות.
6. Resuspend כל 1 תא L גלולה ב 20 מ"ל של המאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ 'KCl, 15 מ"מ Imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 sulphonyl phenylmethyl mM פלואוריד (PMSF) ו benzamidine.
7. פלאש להקפיא resuspended תערובת תאים על ידי לאט מטפטף את התאים לתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטי פלסטיק מלא חנקן נוזלי, כך כל טיפה קופאת על ההשפעה של נוזלי N _2. חנות תאים קפואים ב -80 ° C עד מוכנים לטיהור חלבונים.

2. טיהור Tc טרט

1. תאים להפשיר בטמפרטורת החדר עד למרקם נוזלי הוא הגיע ולאחר מכן לעבור כוסות מתכת על קרח sonication.
2. Sonicate תאים על קרח דק 2 ב 30 מרווחי השני עם 30 second הפסקות, על כ 51 וואט.
3. ספין למטה תאים lysed בסל"ד 18,000 עבור 20 דקות להפריד את החלבון שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ובזהירות להסיר את supernatant עבור כרומטוגרפיה זיקה ניקל.
4. לאזן Ni-נ.ת. ע (ניקל nitrilotriacetic חומצה) טור עם מאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 0.5 מ 'KCl, 15 מ"מ imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ"מ PMSF ו benzamidine.
5. טען supernatant על שרף לאסוף את הזרימה דרך.
6. לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ"מ KCl, 15 מ"מ imidazole, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 מ"מ PMSF כדי להסיר את כל החלבונים מחויב שיורית ולא באופן ספציפי.
7. Elute Tc טרט של שרף Ni-נ.ת. ע באמצעות שיפוע imidazole של 15-300 מ"מ לאסוף 3 שברים מ"ל לניתוח SDS PAGE.
8. השתמש בדף 'ניתוח כדי לקבוע אילו שברים מכילים חלבון Tc טרט ולהתרכז אלה שברים ב Amicon 30 kDa (Millipore) לסנן.
9. תתרכז Tc שברים טרט לנפח פחות מ -10 מ"ל לטיהור נוסף.
10. טרט Tc מטוהרים נוסף על עמודה קטיון מטבע (HS פורוס, Applied Biosystems) מראש equilibrated עם חוצץ המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 KCl mM, ו 1 DTT מ"מ.
11. טען את תערובת החלבונים על העמודה HS פורוס לשטוף אותה להסיר את כל חלבון ומזהמים חומצות גרעין.
12. לשטוף את העמודה עם חוצץ המכיל 500 KCl mM ואחריו mM 700 KCl להסיר כל המזהמים שנותרו.
13. Elute החלבון טרט Tc את הטור HS פורוס עם חיץ 1 KCl ז. בשלב זה החלבון צריך להיות יותר מ 99% טהור.
14. הסר את כל אגרגטים חלבון על ידי העברת חלבון על עמודה אומדת Superdex-200 (הרחקה גודל כרומטוגרפיה - GE Healthcare), טרום equilibrated עם מאגר המכיל 25 מ"מ טריס, pH 7.5, גליצרול 10%, 500 מ"מ KCl, ו 1 TCEP מ"מ.

3. Tribolium castaneum תרבות חיפושית

1. ט castaneum חיפושיות שבה סיפקה בתחילה כמתנה על ידי ד"ר ס 'בראון, חטיבה של ביולוגיה, קנזס סטייט.
2. התחל ט castaneum התרבות על ידי הוספת 100 חיפושיות בוגרות מכולה עם 28.5 גר 'קמח 1.5 גרם של שמרים יבשים של האופה.
3. חנות תרבויות חיפושית בטמפרטורת החדר בסביבה, חשוך ולח במשך שלושה עד ארבעה שבועות, כדי לאפשר רבייה וגדילה. מניחים כוס המכילה מים באזור אחסון חיפושית כדי להבטיח סביבה לחה.
4. קציר הזחלים חיפושית כנדרש עבור בידוד RNA. אפשר הזחלים הנותרים להבשיל למבוגרים, לשמור אותם באותה תרבות.
5. בכל חודש, להעביר את חיפושיות הפעילים ביותר (לא יותר ממאה) לתוך בקבוק חדש המכיל קמח שמרים טריים לחדש אספקת המזון שלהם.

4. ט castaneum סך RNA בידוד

1. 20 קציר חיפושית הזחלים מן התרבות (כל תרבות צריכה להכיל בין הזחלים 5-100) על ידי הפרדתם חיפושיות מבוגר ותרבות קמח / שמרים. סלקו קמח או חלקיקים שמרים המחוברים חיפושיות לפני שחיקה אותם.
2. לחטא את אזור הספסל, המלט, ואת העלי (לשקול טיפול בכפפות גם) המשמש בהליך זה עם RNaseZap (Ambion, Inc) כדי להסיר את כל עקבות של ribonucleases לפני שחיקה החיפושיות.
3. טוחנים הזחלים בנוזל N ₂ לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי ו transfer את האבקה אל צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, תוך שמירה על נוזלי N ₂ על מנת להבטיח כי האבקה נשאר קפוא עד החיץ החילוץ הוא הוסיף.
4. אפשר נוזל עודף N ₂ להתאדות מן האבקה. לאחר N נוזלי ₂ התאדו, homogenize את אבקת חיפושית ב 200 μl של חיץ החילוץ (לכל הזחלים 20 חיפושית) המכיל 25 מ"מ טריס-HCl, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, 1 mM EGTA, benzamidine 0.1 מ"מ, 200 מ"מ KCl, 10 גליצרול%, 10 mM imidazole ו 20U של RNasin, pH 7.5 ו לדגור על קרח במשך 30 דקות.
5. צנטריפוגה homogenate 15,000 סל"ד במשך 20 דקות ב 4 ° C, לאסוף את supernatant ופלאש להקפיא את מדגם N נוזלי _2. במידת הצורך, ניתן לאחסן דגימות ב -80 ° C במשך הלילה.
6. חלץ את סך RNA באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen).

5. הכינון מחדש במבחנה של telomerase castaneum Tribolium

1. מערבבים 20 מיקרוגרם של רקומביננטי שלו מתויג Tc טרט עם 50 μl של ט ' castaneum RNA סך למאגר מחייב המכיל 25 מ"מ טריס-HCl, 200 מ"מ KCl, גליצרול 10%, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, 10 mM imidazole, pH 7.5.
2. דגירה טרט Tc - סך הכל תערובת RNA במשך שעתיים על 22 מעלות צלזיוס ט castaneum lysate בנוכחות מעכב RNasin כדי למנוע השפלה RNA.
3. לטהר את מורכבות על עמודה Ni-נ.ת. ע כדי להסיר זיהומים lysate ו-RNA עודף.

6. לחזור telomerase הגברה פרוטוקול (מלכודת) מבחני

1. מערבבים 4 מיקרוגרם של Ni-נ.ת. ע מטוהרים ט telomerase castaneum במאגר התארכות 50 μl המכיל 20 מ"מ טריס-HCl (pH - 8.3), 7.5 mM MgCl _2, 63 mM KCl, 0.05% Tween 20, 1 mM EGTA, BSA 0.01%, 0.5 dNTPs מ"מ, 1 מיקרומטר TCAs-TS דנ"א פריימר (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 "), ואת דגירה את התערובת על 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לאפשר התארכות של פריימר TCAs-TS את ה-DNA על ידי T. מחדש castaneum telomerase.
2. חלץ את ה-DNA מוארכת חד גדילי (ssDNA) על ידי הוספת נפח שווה של פנול כלורופורם לתערובת התגובה. לנער את התערובת בעדינות עד אמולסיה היא הומוגנית.
3. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 12,000 למשך חמש דקות בשעה 4 ° C כדי להפריד את ssDNA של מזהמים.
4. מעבירים את השכבה המימית העליון של המדגם כדי צינור 1.5 Eppendorf מ"ל; להוסיף הריכוז הסופי של 10 mM NaOAc (pH 5.0), 1 מ"מ MgCl _2, ו - 66.4% EtOH ולאחר מכן לאפשר את המדגם כדי לזרז לילה ב -20 ° ג
5. ספין המדגם בסל"ד 15,000 במשך שלושים דקות 4 ° C עד גלולה ssDNA זירז. למזוג את הפתרון באמצעות pipettor ולאחר מכן להוסיף 200 μl של EtOH 70% המדגם לשטוף NaOAc הנותרים MgCl ₂ מן המדגם. צנטריפוגה מדגם במשך חמש דקות במהירות את הטמפרטורה באותו המדגם מחדש גלולה.
6. למזוג את הפתרון EtOH באמצעות pipettor ולהסיר שאריות של אתנול בכך שהוא מאפשר את הצינור Eppendorf כדי לדגור לפתוח בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר בהווה אתנול במדגם יפריע לשלב הגברה PCR.
7. Resuspend גלולה ssDNA (המכיל את המוצר telomerase מאורכים תחל TCAs-TS) ב 50 μl של חיץ תגובת PCR המכיל 10 mM טריס-HCl (pH 8), 50 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl _2, 100 dNTPs מיקרומטר (dATP, dGTP ו dTTP), 10 מיקרומטר ^[32 טז] dCTP, 1 TCAs-CX מיקרומטר פריימר (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ") ו - 1.25 U-DNA פולימראז תקי.
8. PCR להגביר את התארכות telomerase המוצרים (29 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, ו - 72 ° C עבור 1 דקה), כך שהם נראים על ג'ל polyacrylamide 12%.
9. טרום להפעיל את הג'ל עם 12% טריס-borate-EDTA (TBE) מפעיל מאגר המכיל 44.5 mM טריס, חומצה 44.5 mM בור, 1 mM EDTA, pH 8 במשך שלושים דקות לפני ריצה את דגימות ה-PCR. לאחר שלפני ריצה טעינת ג'ל עם התגובות PCR, הפעל את הג'ל על 185 וולט עבור 1.5-2 שעות 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
10. יבש את הג'ל ולהשתמש צלחת הדמיה זרחן לדמיין פעילות.

7. נציג תוצאות:

דוגמה של Tc מטוהרים כרומטוגרפיה טרט לאחר הרחקה גודל מוצג באיור 2. חלבון מרוכז לאחר טיהור מנוהלת על ג'ל SDS-polyacrylamide 12% ו מוצגת להיות יותר מ 99% טהור (איור 2 א). הדרה גודל (S200) chromatogram הוא גם סיפק (תרשים 2B) כדי להדגים את חוסר הטוהר של אגרגטים מן המדגם חלבון מטוהרים. תשואה של 5 מ"ג חלבון אחרי כל השלבים לטיהור הושלמו מתקבל בדרך כלל על אף התשואה הסופית יכולה להשתנות.

מלכודת נציג assay עבור ט מחדש telomerase castaneum מוצג באיור 3 כפי שדווח קודם לכן על ידי מיטשל et al. ^12. הסולם צעד נבון של מוצרים telomerase ניתן לראות במסלול 1, אולםהם נעדרים telomerase הן RNase מטופלים הפעיל טרט אתר מוטנט (D251A) דגימות מסלולים 2 ו -3 בהתאמה.

באיור 1. תרשים זרימה של שלבי הכינון מחדש של רקומביננטי Tc טרט. ראשית, רקומביננטי Tc טרט היא ביטוי יתר של E. coli. חלבון הוא מטוהרים מכן על ידי ניקל, חילופי קטיונים, והדרה כרומטוגרפיה גודל. ט חיפושיות castaneum הם מתורבת בבית וזחלים שלהם משמשים כדי לבודד את הרנ"א מוחלט. Tc מטוהרים טרט ואת RNA סך מעורבבים ואז לחדש את מורכבות RNP telomerase, וכן assay המלכודת הבאים משמש כדי לאשר את מורכבות RNP הוא telomerase פעיל.

איור 2. הדרה גודל chromatogram וניתוח SDS PAGE של חלבון טרט Tc. (א) 12% SDS-polyacrylamide ג'ל של החלבון Tc טרט לאחר כרומטוגרפיה הדרה גודל. החלבון טרט Tc (70 KDA) נודד מהר יותר על ג'ל SDS PAGE כי יש לו נקודה isoelectric גבוהה (PI - 9.8). (ב) הרחקה גודל chromatogram (Superdex S200) של החלבון Tc טרט.

איור 3. מבחני המלכודת של במבחנה מחדש telomerase Tribolium castaneum עיבוד מיטשל et al. ^12. ליין 1: בר סוג Tc טרט ו-RNA שבודד סך זחלי החיפושית. ליין 2: בר סוג Tc טרט ו RNase טיפול הכולל זחלים RNA ותמציות התא. ליין 3: פעיל באתר מוטציה Tc טרט (D251A) וסך זחלי החיפושית RNA הזחלים.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מאפשרת ייצור של כמויות גדולות של למקטע הקטליטית של ט ' castaneum טרט telomerase בצורת, מסיסים פעיל ללימודי מבניים ביוכימיים. השיטה של Tc טרט יתר ביטוי רגיש שינויים עדינים בטמפרטורה או צפיפות התאים מאלה כאמור לעיל יכול להשפיע באופן דרמטי את רמות ביטו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
רוזטה (DE3) plysS תאים	Novagen	70956
2YT מרק	Teknova	Y0215
IPTG	זהב ביוטכנולוגיה	I2481C
MISONIX Sonicator 3000	Qsonica, LLC.
אקטע מטהר FPLC	GE מדעי החיים
Ni-נ.ת. ע Superflow שרף	Qiagen	30410
Amicon Ultra-15 מכשיר סינון צנטריפוגלי	Millipore	UFC903008
פורוס 50 HS-Exchange הקטיון חזקה אריזה	Applied Biosystems	1-3359-06
פורוס 50 HQ Exchange הקטיון חזקה אריזה	Applied Biosystems	1-2559-06
Superdex 200 10/300 גודל, הרחקת טור	GE מדעי החיים	17-5175-01
פנול: כלורופורם: Isoamyl 25:24:1 עם 10mm טריס, pH 8, 1mm EDTA	סיגמא	P3803-100 מ"ל
RNaseZap	Ambion	AM9780
רקומביננטי אינהיביטור Ribonuclease Rnasin	Promega	N251B
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
ה-DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies