A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
צבעים biarsenical פלאש ReAsH להיקשר באופן ספציפי מוטיבים tetracysteine בחלבונים והוא יכול סלקטיבי תווית חלבונים בתאים חיים. לאחרונה באסטרטגיה זו תיוג נעשה שימוש כדי לפתח חיישנים עבור תצורות חלבונים שונים או מדינות oligomeric. אנו מתארים את גישת התיוג ושיטות כמותית לנתח מחייב.
חלבונים פלורסנט וצבעים הם כלים חיוניים לחקר לוקליזציה סחר, חלבונים לתפקד בתאים. בעוד חלבוני ניאון כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נעשה שימוש נרחב כשותפים היתוך חלבונים כדי לעקוב אחר תכונות של חלבון של עניין 1, ההתפתחויות האחרונות עם תגיות קטנות מאפשרות פונקציות חדשות של חלבונים להיבחן בתאים כגון שינוי קונפורמציה וחלבון אסוציאציה 2, 3. אחת מערכת תג קטן כרוך מוטיב tetracysteine (CCXXCC) מוכנס לתוך גנטית חלבון מטרה, אשר נקשר צבעים biarsenical, ReAsH (אדום ניאון) ו-Flash (ירוק זרחני), עם סגוליות גבוהה אפילו בתאים חיים 2. מערכת TC / biarsenical לצבוע מציעה אילוצים סטרית הרבה פחות חלבון מאשר לארח חלבוני ניאון אשר אפשרה מספר גישות חדשות כדי למדוד שינוי קונפורמציה ו חלבונים אינטראקציות 4-7. אנחנו לאחרונה פיתחה יישום הרומן של תגיות TC כמו חיישנים של oligomerization בתאים לבטא huntingtin מוטנטים, אשר כאשר מוטציה אגרגטים נוירונים מחלת הנטינגטון 7. Huntingtin היה מתויג עם שני צבעי ניאון, אחד חלבון פלואורסצנטי לעקוב אחר המיקום חלבון, ואת תג שנייה TC שרק נקשר צבעים biarsenical ב מונומרים. לפיכך, שינויים colocalization בין חלבון תגובתיות לצבוע biarsenical מופעלת תוכן oligomer submicroscopic להיות ממופה מרחבית בתוך התאים. כאן אנו מתארים כיצד תווית TC-tagged חלבונים התמזגו חלבון פלואורסצנטי (שרי, GFP או CFP) עם פלאש או ReAsH בתאי יונקים לחיות וכיצד לכמת את הקרינה two צבע (שרי / Flash, CFP / Flash או ה-GFP / ReAsH שילובים).
1. הכנת תאים עם תיוג ReAsH / פלאש
הערה חשוב להשתמש בפקדי חיוביים ושליליים כדי להעריך את מידת מחייב ספציפית את התגיות TC ולהעריך עבור bleedthrough של הקרינה בין הערוצים בעת איסוף micrographs confocal. לפיכך, עבור שני צבעים (לדוגמה Flash / או שרי ReAsH / או CFP ReAsH / GFP שילובים), להבטיח דגימות מוכנים צבעים בודד (חלבון פלואורסצנטי למשל לבד או אם אפשר חלבון TC-tagged חייב Flash / ReAsH אך ללא פלורסנט חלבון)
חשוב להוסיף EDT הראשון לפני הוספת Flash / ReAsH ולהפוך את המאגר רק לפני הוספתו התאים. דגירה של 30 דקות בדיוק בשעה 37 ° C ברקמות תרבות חממה. כבר בשנת הניסיון שלנו פעמים הדגירה מגביר באופן משמעותי את הקרינה רקע. בונה חדש צריך להיות גם מותאם תיוג זמן Flash / ReAsH ריכוז (0.5-2 מיקרומטר).
אחרי זה לשטוף, התאים עשויים להיות קבועים עם paraformaldehyde (15 דקות עם פתרון 3.2%), אם כי מצאנו כי זה מגביר את הלא ספציפית צבע פלואורסצנטי biarsenical. לכן אנחנו בדרך כלל תמונה תאים חיים בטמפרטורת החדר. (שים לב קיבעון של תאים לפני תיוג מונע מחייב לצבוע biarsenical).
2. דימות את התאים במיקרוסקופ confocal
3. ניתוח הנתונים
4. נציג התוצאות:
ההצלחה של תאים תיוג עם צבעים biarsenical תלוי כמה פרמטרים מרכזיים. ראשית, העיתוי של תיוג עם צבעים היא קריטית. מצאנו כי תקופות ממושכות של תיוג (יותר מ 30 דקות) תוצאות ברמה גבוהה של מכתים הלא ספציפית רקע. איור 1 מציג תוצאה אופיינית טופס wild-type של שבר huntingtin (25Q) התמזגו Cerulean נגזרת CFP המכיל תג TC כפי שתואר לעיל 7. מדגם זה היה מוכתם למשך 30 דקות עם ReAsH ויש רקע מינימלי במדגם חסרים את תג TC. מצאנו כי קיבוע תאים עם רקע עליות paraformaldehyde תוך קיבוע עם מתנול מבטלת את הקרינה של תג חלבון פלואורסצנטי. לפיכך במידת האפשר אנו התמונה תאים חיים. חשוב גם לציין כי הקיבעון מוקדמתעל תיוג עם צבעים biarsenical מונע, מחייב שלהם כנראה בשל שינויים של מוטיב TC.
גורם קריטי עבור תוצאות עקביות היא צפיפות של תאים. מצאנו זה קריטי תאים התמונה מופצים באופן רופף וגם כי clumping נרחב יכול להוביל מכתים אחידה של צבעי biarsenical בתאים שונים.
באיור 1. התגיות Tetracysteine והכתים ReAsH בתאים חיים transfected עם huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean fusions. תג TC ממוקם בצומת של היתוך huntingtin-Cerulean (כפי שמתואר 7). העלילה פיקסל מתאם עוצמת מאפשר הערכה להבדלים ReAsH מחייב ברחבי התא והוא יכול לשמש כדי למפות שינויים ReAsH מחייב עקב שינוי קונפורמציה או אינטראקציות ליגנד.
הגישה לוקליזציה חלבון תווית עם חלבון פלואורסצנטי ומאפיינים קונפורמציה עם צבע שנייה מציע הרבה פוטנציאל למיפוי בו תצורות שונות של חלבונים בתאים לצבור ואירועים לשנות את הדינמיקה של קונפורמציה בחלבון. ReAsH / פלאש שימש לראשונה כחיישן ב-cell עבור קיפול חלבונים של חלבון יונק?...
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
עבודה זו מומנה על ידי מענקים DMH ו TDM (NHMRC מענקים הפרוייקט). DMH הוא עמית Grimwade, שמומן על ידי הקרן Miegunyah.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
---|---|---|---|
8-μ היטב-שקופיות | Ibidi | 80826 | אנו מוצאים קאמרית אלה שקופיות להיות שימושי במיוחד עבור תאים culturing הדמיה. |
TC-Flash השנייה בתוך תא איתור Tetracysteine תג קיט * * * פלואורסצנטי ירוק עבור לגור תאים הדמיה | Invitrogen | T34561 (Flash) או T34562 (ReAsH) | |
הנקס "פתרון מאוזן מלח | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-Dimercapto-1-propanol | סיגמא אולדריץ | D1129-5 מ"ל | |
1,2-Ethanedithiol | סיגמא אולדריץ | 02390-25ML |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved