הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Summary

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי ב א coli. השיטה מסתמכת על readout ויזואלית פשוטה של ​​השפלה המצע, אינו דורש טיהור האנזים, והיא ניתנת להרחבה. זה מאפשר הקרנה מהירה של ספריות גדולות של וריאנטים של האנזים.

Abstract

Cellulase אנזימים (endoglucanases, cellobiohydrolases, ו β-glucosidases) hydrolyze תאית לסוכרים רכיב, אשר בתורו יכול להיות מומר כהלים דלק ^1. הפוטנציאל הידרוליזה אנזימטית של ביומסה cellulosic לספק אנרגיה מתחדשת הגביר את המאמצים מהנדס cellulases עבור ² דלק חסכוני הייצור. עניין מיוחד הם cellulases פטרייתי ^3-8, אשר כבר נמצאים בשימוש תעשייתי עבור מזונות ועיבוד טקסטיל.

זיהוי וריאנטים פעיל בין ספריה של cellulases מוטציה הוא קריטי לתהליך ההנדסה; מוטנטים פעילים ניתן לבדוק נוספת תכונות משופרות ו / או נתון mutagenesis נוספים. הנדסה יעיל של cellulases פטרייתי כבר הקשו על ידי היעדר כלים גנטית אורגניזמים מקומיים על ידי קשיים בהבעת האנזימים המארחים Heterologous. לאחרונה, פיתח Morikawa ועמיתיו שיטה לביטוי ב E. coli התחומים הקטליטית של endoglucanases מ ח jecorina ^3,9, פטריות תעשייתי חשוב עם יכולת להפריש cellulases בכמויות גדולות. פונקציונלית E. הביטוי coli כבר דווח על cellulases מן פטריות אחרים, כולל Macrophomina phaseolina ¹⁰ ו Phanerochaete chrysosporium ^11-12.

אנו מציגים שיטה ההקרנה תפוקה גבוהה של פעילות endoglucanase פטרייתי ב E. coli. (איור 1) שיטה זו משתמשת חיידקים המשותף צבען האדום קונגו (CR) כדי להמחיש השפלה אנזימטית של תאית carboxymethyl (CMC) על ידי תאים גוברת על בינוני מוצק. Assay פעילות דורשת ריאגנטים זולה, מניפולציה מינימלית, נותן תוצאות חד משמעיות כמו אזורי השפלה ("הילות") במקום מושבה. למרות מדד כמותי של הפעילות האנזימטית לא ניתן לקבוע לפי שיטה זו, מצאנו כי גודל הילה בקורלציה עם הפעילות האנזימטית הכולל בתא. אפיון נוסף של שיבוטים חיובי הפרט יקבע, כושר חלבון יחסית.

מסורתית חיידקי כל CMC / CR תא פעילות מבחני ¹³ לערב לשפוך CMC אגר המכיל על מושבות, אשר כפופה זיהום צולב, או תרבויות דוגרים בבארות אגר CMC, המהווה פחות נגישה ניסויים בקנה מידה גדול. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול משופר משנה לשטוף שיטות קיימות ¹⁴ לפעילות cellulase: התאים גדלו על צלחות אגר CMC מוסרים לפני מכתים CR. פרוטוקול שלנו מפחית באופן משמעותי את זיהום צולבות היא מדרגית, המאפשר הקרנת מהירה של אלפי שיבוטים. בנוסף ח אנזימים jecorina, יש לנו הביע הוקרן וריאנטים endoglucanase מן aurantiacus Thermoascus ו Penicillium decumbens (שמוצג באיור 2), טוען כי פרוטוקול זה הוא ישים אנזימים מתוך מגוון רחב של אורגניזמים.

Protocol

1. צלחת הקרנת הכנה

1. הוסף LB 25 גרם צמיחה בינוני, אגר 15g ו 1.5g carboxymethyl תאית (CMC) המצע במים מזוקקים עד 1 ליטר ו החיטוי לעקר.
2. לאחר מעוקר, לאפשר בינוני להצטנן ולהוסיף אנטיביוטיקה המתאימה IPTG לריכוז סופי של 100μM.
3. יוצקים לתוך כל אחד בינוני 200 מ"ל 5 צלחות פטרי גדול מרובע / מגשים המבדק (240 x 240 x 20 מ"מ או יותר). אפשר צלחות להתייבש לחלוטין.

2. Endoglucanase הדור ספריה מסך

1. יצירת ספרייה של תחום קטליטי endoglucanase (ים). ניתן להשיג בדרכים רבות (למשל, אתר מכוונת או mutagenesis רקומבינציה אקראית, וכו ') נקבעת על ידי החוקר.
2. Clone הספרייה לתוך וקטור כזה כי הם תחת שליטתה של האמרגן T7 עם המפעיל לאק, ומכילים רצף האות pelB עבור המיקוד periplasm. דוגמה וקטור מתאים pET22b (+) מ Novagen.
3. המרה הספרייה endoglucanase לתוך E. coli זן BL21 (DE3) ו צלחת מושבות אחת.
4. דגירה שינוי בן לילה ב 37 ° C.
5. בעזרת קיסמים סטרילי, לחסן שיבוטים לתוך 96 צלחות היטב היטב עמוק המכיל מדיום LB 400μL בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד בסל"ד 250.
6. הוסף גליצרול סטרילי עד 96 תרבויות לילה טוב לריכוז סופי של 10% עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. זו תהיה צלחת מאסטר.
7. באמצעות חותמת 96 פינים, לשכפל תרבויות צלחת לילה על גבי צלחות ההקרנה המכיל IPTG ו CMC. עד 5 סטים של תרבויות לילה יכול להיות מוטבע על כל צלחת ההקרנה.
8. לייבל צלחות ההקרנה כך זהות והכיוון של הצלחת 96 כל טוב ידוע.
9. דגירה הספריות חותמת בטמפרטורת החדר (17-25 מעלות) למשך הלילה או עד מושבות גלוי יצרו.
10. לשטוף צלחת עם מים מזוקקים עד כל עקבות המושבות יוסרו.
11. יוצקים קונגו האדום (CR; 0.5% במים) לצלחת שטף. הקפד להוסיף CR מספיק כדי לכסות את הצלחת.
12. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. לא יעלה על 15 דקות הדגירה CR. פעמים הדגירה ארוכים תגרום הילות פחות ברורים.
13. יוצקים את CR ומוסיפים כמות נדיבה (יותר ממספיק כדי לכסות את צלחת) של NaCl 1M.
14. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר.
15. יוצקים את NaCl לחשוף הילות השפלה CMC. לקבלת רזולוציה טובה יותר של הילות, פעמים הדגירה כבר עם מכבסת NaCl NaCl או מרובים ייתכן שתידרש.
16. בעזרת קיסם סטרילי, להרים פעיל שיבוטים אנזימים מהצלחת האב אפיון נוסף.

3. נציג תוצאות:

דוגמה readout עבור תפוקה גבוהה במסך זה מוצג באיור 3. המשובטים ניתן לזהות פעיל, פעיל חלושות, ופעיל מאוד בהתבסס על גודל של אזורי השפלה. תכונה זו שימושית במיוחד אם אנזים הפעילות ידוע נכלל בספריה כהפניה. כפי שמוצג כאן, זיהוי של אנזימים פעילים איתנה לשחזור. עם זאת, יש להיות מודעים לכך תיוג נאותה של לוחות ההקרנה הוא מאוד חשוב. החוקר חייב להיות מסוגל לזהות גרסאות פעיל לאחר כביסה המושבות משם, על מנת לאסוף אותם מהצלחת האב מאוחסנים -80 ° C לאפיון נוסף. לבסוף, קשה להעריך מראש את הקשר בין פעילות על מצעים מלאכותיים מול טבעיים. לכן, החוקר חייב לבדוק את כל שיבוטים חיובית על חומר תעשייתי רלוונטי לקביעת כושר חלבון.

באיור 1. מתווה סכמטי של תהליך המיון. תאים הופכים עם ספריה endoglucanase ו מצופה סלקטיבי עבור מושבות אחת. המשובטים הרים גדל בן לילה לאחסון (1) ב -80 ° C ו (2) ציפוי העתק על צלחות המכילות CMC ו IPTG לגרום ביטוי endoglucanase ב 96 צלחות היטב עמוק היטב. שיבוטים פעילים נקטפים מהצלחת האב מאוחסנים -80 ° C.

איור 2. שיבוט וביטוי של תחומים קטליטי פטרייתי ב E. coli. (א) וקטור Endoglucanase הביטוי. הגנים היו משובטים לתוך pET22b (+) (Novagen) תחת שליטה של ​​האמרגן T7. (ב) פאנל ימין: endoglucanase-לבטא BL21 (DE3) המושבות. פאנל משמאל: הילות השפלה CMC לאחר שטיפה ופיתוח עם קונגו האדום.

איור 3. תוצאות המדגם מן המסך האדום CMC / קונגו. תמונות שצולמו של צלחות ההקרנה לאחר שטיפה ופיתוח קונגו האדום. כל מושבות על זהצלחות creening היו בסדר גודל דומה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר תפוקה גבוהה של אנזימים פעילים, עם מניפולציה מינימלית. איתור פעילות רגיש למדי, איכותית משקף את היקף הפעילות בתוך התא. קלות השימוש שעושה שיטה זו מתאימה למגוון רחב של ספריות האנזים, מוגבל רק על ידי ביטוי פונקציונלית E. coli. יתר על כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר מוצר
IPTG	סיגמא	I1284
קונגו אדום	סיגמא	C6277
Carboxymethyl תאית	סיגמא	360384
NaCl	סיגמא	S1679
Bacto-agar	BD Biosciences	214030
המבדק צלחות	Thermo Scientific	240845