Method Article
מחקר זה מתאר שיטה המאפשרת אבחון המהיר וברור של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום באמצעות שילוב של הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ושיטות צביעה שליליות.
חקירות של שינויי ultrastructural נגרמים על ידי וירוסים לעתים קרובות יש צורך לזהות בבירור מחלות ויראליות בצמחים. עם הכנת מדגם קונבנציונלית למיקרוסקופיה אלקטרוני הילוכים (TEM) חקירות כאלה יכולות לקחת כמה ימים 1,2 ולכן אינו מתאימות לאבחון מהיר של מחלות נגיפיות צמח. קיבעון מיקרוגל יכול לשמש בצורה דרסטית כדי לקצר את זמן הכנת מדגם לחקירות TEM עם תוצאות דומות לאלו של ultrastructural נצפה לאחר קונבנציונלית הכנת מדגם 3-5. מכשירים רבים ושונים בהתאמה אישית מיקרוגל זמינים כרגע שיכול לשמש לקיבוע וההטמעה של דגימות ביולוגיות לחקירות TEM 5-8 המוצלחים. במחקר זה אנו מראים על וירוס פסיפס טבק (TMV) נגוע צמחי tabacum Nicotiana כי ניתן לאבחן שינויים בultrastructural עלים כבחצי יום באמצעות הכנת מדגם מיקרוגל סיוע עבור TEM. יש לנו נבחרנו לבצע את המחקר הזה עם מכשיר מיקרוגל זמין מסחרי כפי שהוא מבצע הכנת מדגם כמעט במלואו באופן אוטומטי 5 בניגוד למכשירים האחרים הזמינים בו צעדים רבים עדיין צריכות להתבצע באופן ידני 6-8 והם יותר ולכן זמן רב עבודה. כהכנת מדגם מתבצעת באופן אוטומטי לחלוטין מכתים שלילי של חלקיקים נגיפיים בלשד העלים TMV הנגועים הנותרים והבחינה הבאה של ultrastructure וגודל ניתן לבצע במהלך קיבעון והטבעה.
הכנת מדגם מיקרוגל סיוע
2. זמירה וחתך
3. מכתים שלילי
4. ניתוח תמונה
5. תוצאות נציג:
לאחר שינויי מיקרוגל סייעו מדגם הכנה טיפוסיים TMV מושרים ultrastructural כגון שטחים גדולים המכילים נגיפים מיושרים בצורה מקבילה יכולים להיות שנצפו במיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים בcytosol של Nicotian הנגועבתאי tabacum (האיור 1 א). בנוסף, במוהל הגולמי של נגוע TMV משאיר חלקיקי TMV יכולים להיבחן כמבני flexuous, בצורת מוט לאחר צביעה שלילית (האיור 1B). ניתוח תמונה של 100 חלקיקי נגיף מתגלה גודל ממוצע לTMV של 280nm באורך ורוחב ב17nm (איור 2). Ultrastructure בתאי TMV נגועים ובגודל של נגיפים שנצפו במחקר זה נמצא כי בהתאם למאפייני ultrastructural TMV מושרים בטבק וטווח הגודל של חלקיקי TMV שדווח בעבר בספרות 9-15.
האיור 1. Micrographs אלקטרון ההולכה של תאים וvirions עלים TMV נגועים. א) תמונה מראה את ultrastructure של תאי עלי mesophyll TMV הנגועים של tabacum Nicotiana לאחר הכנת מדגם צמח מוגנת מיקרוגל. שים לב השטח הגדול של נגיפים מיושרים מקבילים אשר נצברו בcytosol.C = הכלורופלסט עם עמילן (סנט), M = mitochondrion, N = גרעין, V = vacuole, בר = 2μm. B) תמונה מראה virions שאותרו על ידי מכתים שלילי במוהל עלים נגועים.
איור 2. גודל יחסי של נגיפים. התפלגות יחסית של אורך ורוחב של TMV חלקיקים לאחר מכתים שלילי מיץ עלים נגועים כפי שהופיעו במיקרוסקופ האלקטרונים. משמעות ערכים (כלומר אורך / רוחב ± סטיית תקן) חושבה מתוך 100 virions.
הכנת מיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM הוכחה לספק נתוני ultrastructural מהירים ואמינים תוך כמה שעות 3,4,16. שימור מבני הקנס של אברונים וקרומים שהושגו עם השיטה המשמשת במחקר זה היה דומה לדגימות קונבנציונליות וcryofixed 5,15 עם היתרון של הפחתה מסיבית בקיבעון מדגם והטבעת הזמן של 3 ימים או יותר לכ 2 שעות. זה מייצג את פרוטוקול הכנת המדגם המהיר ביותר לTEM הזמין כרגע בספרות. השיטה המתוארת במחקר זה בשילוב הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM עם שיטות צביעה שליליות שאפשרו זיהוי ברור ומהיר של שינויי ultrastructural TMV מושרים והסוכן הנגיפי עצמו. שינויי ultrastructural TMV מושרים יכולים להיחקר לאחר זמירה, תבתר ולאחר צביעה בתוך כ 4 שעות לאחר תחילתו של קיבעון בשידור elecטרון מיקרוסקופ. שימוש באופן אוטומטי לחלוטין מצב הכנת הדגימה שחרר חוקר לנהל מכתים שלילי בתקופת ביניים על מנת לקבוע את הגודל ורוחבו של הסוכן הנגיפי. לפיכך, אנו יכולים להסיק כי שיטה זו מאפשרת אבחנה ברורה ומהירה של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום שיש חשיבות רבה לשימוש בעתיד בניסויי חקלאות ומדעית במפעל phytopathology. כשיטה זו יכולה לשמש גם לאבחון המהיר של מחלות בבעלי חיים ובני אדם שיש לו פוטנציאל גדול ליישום עתידי בפתולוגיה רפואית ווטרינרים.
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF, P20619 וP22988 לBZ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
שם המגיב / הציוד | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
Glutaraldehyde | אגר מדעי בע"מ | R1312 | |
tetroxide אוסמיום | אגר מדעי בע"מ | R1022 | |
100 שרף אגר | אגר מדעי בע"מ | R1043 | |
אנהידריד succinic Dodecenyl | אגר מדעי בע"מ | R1051 | |
אנהידריד nadic תיל | אגר מדעי בע"מ | R1081 | |
נזיל dimethylamine | אגר מדעי בע"מ | R1060 | |
להוביל ציטראט | אגר מדעי בע"מ | R1210 | |
תצטט Uranyl | אגר מדעי בע"מ | R1260A | |
חומצת Phosphotungstic | אגר מדעי בע"מ | R1213 | |
Formvar | אגר מדעי בע"מ | R1202 | |
היקה EM AMW | Microsystems היקה | ||
ליקה (רייכרט) Ultratrim | Microsystems היקה | חדש מודל זמין | |
ליקה (רייכרט) Ultracut S | Microsystems היקה | חדש מודל זמין | |
Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
פיליפס CM10 TEM | פיי (לשעבר פיליפס) | חדש מודל זמין | |
התא D | אולימפוס בע"מ | ||
Optimas 6.5.1 | מדיה קיברנטיקה בע"מ | גרסה חדשה זמין |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved