הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Claire N. Medine; Baltasar Lucendo-Villarin; Wenli Zhou; Christopher C. West; David C. Hay

doi:10.3791/2969

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.

Abstract

למרות ההתקדמות רעילות התרופה דוגמנות אדם, תרכובות רבים נכשלים במהלך הניסויים הקליניים, בשל תופעות לוואי צפויות. העלות של מחקרים קליניים הם משמעותיים, ולכן חיוני יותר מסכי הרעלים חזוי מפותחים לפרוס בשלב מוקדם של פיתוח התרופה (Greenhough et al 2010). Hepatocytes האדם מייצגים את המודל הנוכחי זהב סטנדרטי להערכת רעילות התרופה, אבל הם משאב מוגבל כי התערוכה פונקציה משתנה. לכן, השימוש של שורות תאים ורקמות הנציח במודלים של בעלי חיים מועסקים באופן קבוע בשל השפע שלהם. בעוד שני מקורות מידע, הם מוגבלים על ידי פונקציה עניים, השתנות המינים ו / או חוסר יציבות של תרבות (Dalgetty et al 2009). בתאי גזע pluripotent (PSCs) הם מקור חלופה אטרקטיבית של hepatocyte אדם כמו תאים (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs מסוגלים התחדשות עצמית והבחנה לכל סוגי תאים סומטיים נמצא המבוגר ובכך מייצגיםמקור פוטנציאלי בלתי נדלה של תאים מובחנים. פיתחנו הליך פשוט, יעיל ביותר, מקובל אוטומציה התשואות HLCs אדם תפקודית (Hay et al 2008; פלטשר et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011 ו Hay et al 2011). אנו מאמינים כי הטכנולוגיה שלנו יוביל לייצור להרחבה של HLCs עבור גילוי תרופות, מחלות דוגמנות, בניית חוץ הגשמי מכשירים סלולריים ואולי טיפולים להשתלה מבוסס.

Protocol

1. הכנה ראשונית של כל מניות הכימיה ציפוי של תרבות plasticware

כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.

הכנה של האדם גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (hbFGF)
1. הכן 10% פתרון BSA ב PBS ולסנן דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
2. מתוך הפתרון BSA 10% להכין פתרון 0.2% BSA.
3. הוסף 10 מ"ל 0.2% BSA hbFGF solution/100 מיקרוגרם.
4. טרום רטוב 0.22 מיקרומטר לסנן לפי פתרון סינון 5 מ"ל BSA 10% דרך המסנן. מחק את 10 מ"ל BSA לשטוף.
5. סינון hbFGF דרך מסנן מראש הדיחה את.
6. HbFGF Aliquot ב eppendorfs סטרילי לאחסן ב -20 ° C.
הכנת Activin האדם פתרון במלאי
1. הוסף 1 מ"ל של 0.2% BSA לתוך מזרק מראש מסנן רטוב.
2. לדלל את Activin ב BSA 0.2% ריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
3. סנן את פעילויותיוn פתרון aliquot ב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
הכנת פתרון במלאי Wnt3a עכבר
1. הוסף 200 μl של PBS על בקבוקון 2 מיקרוגרם של Wnt3a ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
2. Aliquot ב eppendorfs סטרילי לאחסן ב -20 ° C.
הכנת פתרון HGF האדם במלאי (1000x)
1. לדלל את HGF ב PBS ריכוז מלאי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
2. סנן הפתרון HGF ו aliquot ב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
הכנת פתרון M במלאי Oncostatin (1000x)
1. לדלל את OSM ב PBS ריכוז מלאי של 20 מיקרוגרם / מ"ל.
2. סנן הפתרון aliquot OSM וב eppendorfs סטרילי, לאחסן ב -20 ° C.
ציפוי של תרבות plasticware עם Matrigel
1. להפשיר את 10 המניות מ"ל בקבוק Matrigel לילה ב 4 ° C על הקרח ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של KO-DMEM. מערבבים היטב באמצעות טפטפות מקורר ומאחסנים 1aliquots מ"ל ב -20 ° C.
2. הפשירי aliquot של Matrigel על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות או למשך הלילה, כדי למנוע היווצרות של ג'ל.
3. הוסף 5 מ"ל של קר KO-DMEM כדי matrigel, ומערבבים היטב עם טפטפת.
4. בצע עד 15 מ"ל עם קר KO-DMEM ומערבבים בעזרת פיפטה.
5. הוסף matrigel הצלחת או הבקבוק להיות מצופה (לוח (i))

צלחת / Flask	נפח / טוב או Flask
12 גם צלחת	0.5 מ"ל לכל טוב
6 גם צלחת	1 מ"ל לכל טוב
25cm ² בקבוק	2 מ"ל לכל בקבוק

טבלה 1. כרכים מומלצים של matrigel עבור plasticware ציפוי אופייני לתרבות hESC.

1. דגירה את הצלחת בקבוק מצופה או לילה ב 4 ° C או חדרtempature שעה 1 לפני השימוש.
2. צלחות או צלוחיות אשר היו מצופים matrigel ניתן לאחסן 4 ° C עד 1 בשבוע. הם צריכים להיות מסומן בבירור עם התאריך שהם מצופים. מחק כל הצלחות צלוחיות או לא בשימוש בתוך שבוע.
  1. לפני השימוש לאפשר את המיכל תרבות מצופה לעלות לטמפרטורת החדר בתוך ברדס בתרבית רקמה.
  2. מיד לפני השימוש לשאוב matrigel ולהוסיף את ההשעיה תא לבאר או בקבוק.

2. תחזוקה שוטפת של תרבויות hESC ואפיון

החייאה של קווי hESC
1. הסר hESCs מ אחסון חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
2. מעבירים את ההשעיה תא בקפידה צינור סטרילי המכיל כמה מ"ל של מדיום חם.
3. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה @ מהירות נמוכה 5min (1000 סל"ד).
4. לשאוב את resus supernatant ובעדינות רבהpend את התאים לתוך המדיום ES חם על צלחת שכבה מזין MEF.
5. תאים Refeed יומיומי עם המדיום ES טריים על subconfluence, התאים, התאים דורשים passaging.
HESC תחזוקה שגרתיות
תאים ES מגודלים צלחות או צלוחיות מצופה matrigel. התאים צריכים להיבחן והאכילה יומי:
1. בדוק מתחת למיקרוסקופ על מורפולוגיה, תא זיהום מפגש.
2. לשאוב את המדיום בילו.
3. הוספת נפח מתאים של טרי בינוני עכבר עובריים פיברובלסטים אילף (MEF-CM) + האדם bFGF (ריכוז סופי 4 ng / mL) או אמצעי תשלום בסרום ^6.
תאים Passaging עם collagenase
קווי hESC (H1, H9 ו RCM-1) יגיע מפגש כל 5-7 ימים הבאים passaging ביחס לפצל 01:03. HESCs מעבר מוקדם בנוכחות stroma לגדול לאט את הזמן על matrigel יכול להפוך לגורם חשוב. ESCs אדם לא צריך להיות שמאל יותר מ 14ימים matrigel אותו בשל השפלה מטריקס במקרה זה ייתכן שיהיה צורך למעבר התאים ביחס 1:01 או 1:02 פיצול אם התאים הם subconfluent.

אנזימים דגירה
1. כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.
2. ודא שיש מנה חדשה matrigel בקבוק מצופה או מוכן כאמור בסעיף 1.6.
3. החלט על יחס הפיצול הרצוי עבור התאים. מספר גורמים מעורבים בהחלטה לפצל את היחס:
  1. רמה גבוהה של stroma עם מספרים נמוכים של מושבות: ניתן passaged חזרה לגודל קטן יותר טוב או יכול להיות passaged 01:01 אשר להיפטר כמה stroma ובכך להגדיל את המושבה יחס stroma, לקדם צמיחה hESC.
  2. רמה גבוהה של stroma עם מושבות גדולות, תלוי במספר מושבות, יכול להיות passaged 01:01 או 01:02 אם יש מושבות hESC גדול מספיק.
  3. HESCs צומח אופייני עם str קצתסבתא או לא stroma ו / או בידול ניתן passaged 1:02 או 3.
  4. לשאוב את התקשורת מן הבאר או בקבוק.
  5. לשטוף פעם אחת עם 2 MLS PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
  6. הוספת נפח מתאים של collagenase (200 U / mL מדולל KO-DMEM) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-5 דקות. מ 2 דקות ואילך לבחון באופן קבוע תחת המיקרוסקופ (1 דקות intervals). בנקודה התאים הבדיל מתחילים להמריא ומושבות מתחילים להרים בקצה התאים מוכנים passaged.
אוספות ואיגום hESCs
1. 1. לשאוב collagenase.
  2. לשטוף פעם אחת עם 2 MLS PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
  3. הוספת נפח מתאים של MEF-CM בהתאם יחס הפיצול, ושימוש מגרד תא פיזית להסיר את התאים מפני השטח של טוב או בקבוק, אז triturate gently ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים בעזרת פיפטה 10 מ"ל. חשוב כי hESCs נשמרים גושים של תאים לא שבור לתוך תאים בודדים.
Replating hESCs
1. 1. Replate ההשעיה התא וכתוצאה מכך על גבי צלוחיות חדש matrigel או בארות מצופה.
  2. הפוך את עוצמת הקול של MEF-CM עד 4 מ"ל במשך היטב של צלחת 6 באר.
  3. כאשר הנחת התאים להתסיס חממה מיכל בתרבית רקמה על מנת להבטיח ככל אפילו הפצה אפשרית של מושבות כמו במושבות נוטים להתיישב במרכז התרבות רקמות הצלחת / הבקבוק המשפיעים replating תא והבחנה.
אפיון שגרתיות של אוכלוסיות hESC על ידי זרימת cytometry
1. אוכלוסיות hESC נבחנים דרך cytometry זרימה אחת לחודש עבור סמנים תא גזע כגון אוקטובר 3 / 4, Tra 1-60 ו SSEA-4.
2. hESCאוכלוסיות יוסרו מן המצע שלהם, כמו המתלים תא בודד לאחר טיפול 5 דקות עם טריפסין / EDTA (Invitrogen).
3. Resuspend תאים בודדים בכל 1x10 ⁶ תאים / מ"ל PBS בתוספת BSA 0.1% ו 0.1% אזיד הנתרן.
4. דגירה ההכנות התא 4 ° C עם נוגדנים מתאימים במשך 40 דקות.
5. שטפו פעמיים עם תאים PBS בתוספת BSA 0.1% ו 0.1% אזיד הנתרן להסיר נוגדן מאוגד ו resuspend לנפח סופי של 100 μL ולנתח ידי cytometry הזרימה.
6. נתונים עבור 30,000-40,000 אירועים "חיים" נרכשים עבור כל דגימה באמצעות cytometer קליבר FACS מצויד לייזר 488 ננומטר ונותחו באמצעות תוכנת CellQuest (בקטון דיקינסון, בסן חוזה, קליפורניה). תאים בלא כתם כלולים שולטת. תאים אפופטוטיים המלח יחד עם פסולת הוצאו בניתוח באמצעות שער לחיות אלקטרוני על פיזור קדימה פיזור הפרמטרים בצד.

3. Differentiation של hESCs האנדודרם אל הכבד

הכנת מדיה עבור בידול של hESCs האנדודרם אל הכבד. הכנת כל כלי התקשורת צריכים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic.
1. הכנת RPMI: B27 בינוני תחול על בידול האנדודרם
  1. במשך בינוני B27 RPMI, לערבב RPMI 1640 (500 מ"ל) ו - B27 (50x, 10 מ"ל)
  2. מערבולת לערבב הרכיבים.
  3. מוסיפים את כל המרכיבים ליחידה מסנן המסנן תחת חנות ואקום, בשעה 4 ° C.
2. הכנה של מדיום SR-DMSO על בידול hepatocyte
  1. במשך בינוני SR-DMSO, לערבב 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0.5% L-גלוטמין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 0.1mm β-Mercaptoethanol ו DMSO 1%.
  2. סנן את הפתרון תחת vacum, לאחסן ב 4 ° C ו aliquot ולאחסן ב -20 ° C אם נדרש.
  3. השתמש 4 מ"ל לכל צלחת יפה של 6-היטב, 6 מ"ל לכל בקבוק T25.
3. הכנה של מדיום L15 התבגרות עבור HEPAtocyte התבגרות
  1. עבור L-15 בינוני, 500 מ"ל לערבב ליבוביץ L-15 בינוני, tryptose פוספט מרק (הריכוז הסופי 8.3%), מובטל החום העובר שור בסרום (הריכוז הסופי 8.3%), 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate, 1 מיקרומטר אינסולין (הלבלב שור ), 1% L-גלוטמין, חומצה אסקורבית 0.2%.
  2. סנן את הפתרון תחת vacum, לאחסן ב 4 ° C ו aliquot ולאחסן ב -20 ° C אם נדרש.
4. הכנת RPMI סופי: B27 בינוני תחול
  1. לוותר על נפח הנדרש בינוני תחול לניסוי (1 מ"ל לכל צלחת יפה של 6 באר, 2 מ"ל לכל בקבוק T25).
  2. הוסף Activin לריכוז סופי של 100 ng / mL.
  3. הוסף רקומביננטי Wnt3a לריכוז סופי של 50 ng / mL.
  4. מערבבים היטב בכלי התקשורת עכשיו הוא מוכן לשימוש.
  5. מדיה זו הסופי צריך להיות מורכב טריים כל יום.
5. הכנת הסופי בינוני L-15 התבגרות
  1. לוותר על הנדרשנפח בינוני L-15 עבור הניסוי (4 מ"ל לכל צלחת יפה של 6 באר, ו 6 מ"ל לכל בקבוק T25).
  2. הוסף HGF לריכוז סופי של 10 ng / mL.
  3. הוסף OSM לריכוז סופי של 20 ng / mL.
  4. מערבבים היטב בכלי התקשורת עכשיו הוא מוכן לשימוש.
  5. מדיה זו הסופי צריך להיות מורכב טריים כל יום.
תחול hESCs כדי האנדודרם סופי
1. תרבות hESCs (H1, H9 ו RCM-1) ולהפיץ על צלחות מצופה matrigel עם פיברובלסטים עכבר עובריים MEF-CM בתוספת bFGF.
2. ליזום בידול הכבד כאשר hESCs להגיע לרמה confluency של כ -30% -60% (תלוי בקו hESC) על ידי החלפת MEF-CM עם המדיום תחול (RPMI 1640-B27 בתוספת 100 ng / mL Activin ו 50 ng / mL Wnt3a.
3. התאים בתרבית בינוני תחול במשך 3 ימים (שינוי בינונית כל 24 שעות), בינוני תחול הסופי עם Activin ו Wnt3a מורכב טרי בכל יום.
4. לאחר 72 שעות בינוני תחול, שינוי בינוני עד בינוני הבידול השני (SR-DMSO) במשך 5 ימים (שינוי בינונית כל 48 שעות).
5. תרבות יום ב 8 התאים בינוני התבגרות ותחזוקה (L-15) בתוספת 10 ng / mL hHGF ו 20 ng / mL OSM עבור 9 ימים (שינוי בינוני כל 48 שעות). התבגרות ותחזוקה בינוני עם hHGF ו OSM מורכב טריים כל יום.
6. התאים בהדרגה התערוכה שינויים מורפולוגיים מהצורה קוצים / משולש מורפולוגיה הכבד המאפיין הצגת מראה מצולע (איור 2A).
7. Schematic עבור בידול hepato הסלולר:

figure-protocol-15437

4. אפיון האנדודרם נגזר hESC הכבד

Immunostaining
1. לשטוף HLCs hESC נגזר עם PBS פעמיים, 1 דקה כל לשטוף.
2. תקן את HLCs עם PFA 4% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, (התאזה יכול להיות מאוחסן PBS ב 4 ° C ו מוכתם במועד מאוחר יותר). התאים יכולים גם להיות קבוע עם מתנול קר קרח למשך 10 דקות ב -20 ° C.
3. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
4. דגירה התאים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר עם אתנול 100% מכתים גרעיני (שלב זה אינו נחוץ אם קיבעון מתנול משמש).
5. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
6. חסום את התאים עם PBS / T (0.1% tween) / BSA 10% במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
7. הסר את חוצץ חסימת ומוסיפים את הנוגדן העיקרי בהתאמה מדולל PBS / T (0.1% tween) / BSA 1% ו דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, או לילה ב 4 ° C בהתרגשות.
8. שוטפים את התאים 3 פעמים עם PBS / T (0.1% tween) / 1 BSA% בטמפרטורת החדר, 5 דקות כל אחד לשטוף.
9. הוסף המתאים משני אלקסה פלואוריד נוגדן (1:400) מדולל PBS אל התאים דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 בחושך בהתרגשות.
10. שוטפים את התאים 3 פעמים עם PBS, 5 דקות כל אחד לשטוף.
11. הר כל טוב עם MOWIOL 4-88 ו DAPI (1:1000). מכסים היטב עם פליטת כיסוי, לחיצה על coverslip בעדינות על מנת להבטיח כי כל בועות האוויר מוסרים ולאחסן ב 4 ° C בחושך.
RNA בידוד מיצוי
1. שטפו את HLCs hESC נגזר עם PBS ואת לשאוב.
2. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט TRIZOL ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
3. גרדו את התאים ומכניסים 1.5 מ"ל Eppendorf (החנות ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר אם נדרש).
4. הוסף 0.5 מ"ל של כלורופורם על Eppendorf ומערבבים על ידי היפוך, לוודא שזה נעשה במנדף קטר.
5. צנטריפוגה הפתרון ב 13,000 סל"ד במשך 15 דקות 4 ° C.
6. אסוף את השכבה במקום מימיות לתוך Eppendorf נקי, יש לוודא שאין זיהום מממשק.
7. הוסף 1 מ"ל של isopropanol ומערבבים על ידי היפוך, להשאיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות precipiטייט רנ"א.
8. צנטריפוגה ב 13,000 סל"ד במשך 10 דקות 4 ° C.
9. לשאוב supernatant ולוודא לא להפריע גלולה RNA. לשטוף עם 0.5 מ"ל של אתנול 70% ומשאירים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
10. צנטריפוגה ב 8000 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C.
11. לשאוב אתנול ולהשאיר לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
12. לאחר כל אתנול התאדו, resuspend את הכדור ב 30 μl מים deionised. חנות RNA ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
13. לכמת את ריכוז RNA באמצעות nanodrop.
שעתוק לאחור PCR
1. הגדרת התגובה באמצעות בעבר RNA בודד (200 ng), hexamers אקראי, נוקלאוטידים (10mm) transcriptase הפוכה ו חיץ בהתאמה דקה חומה 0.5 מ"ל Eppendorf.
2. הגדרת RT שלילית, התגובה לעיל ללא transcriptase הפוכה.
3. מניחים את צינורות לתוך Cycler תרמו, המכונה PCR, וכן להגדיר את p הבאיםrogram:
  1. 37 ° C - 5 דקות (1 מחזור)
  2. 42 ° C - 1 שעה (1 מחזור)
  3. 95 ° C - 5 דקות (1 מחזור)
4. חנות cDNA ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר במידת הצורך.
TaqMan transcriptase כמותי הפוך פולימראז שרשרת קציר תגובת התאים בנקודות זמן שונות לאורך הפרוטוקול בידול. חלץ את RNA ולבצע qPCR שעתוק לאחור באמצעות primers הבאים Assay על פי דרישה, (Applied Biosystems) פרוטוקול:
1. אוקטובר 4 Hs03005111_g1
2. Nanog Hs02387400_g1
3. אלבומין Hs00910225_m1
4. אלפא fetoprotein Hs00173490_m1

עבור בידוד RNA ו מיצוי אנא עיין בסעיף 3.3.2

שעתוק הפוך ו TaqMan qPCR
1. קח 1 מיקרוגרם של רנ"א הפוך לתמלל את cDNA באמצעות כתב עילי של Invitrogen שעתוק III הפוכההערכה, לפי הוראות היצרן.
2. 1 μl של cDNA המשמשים תגובה 25 TaqMan μl המורכב של primers המתאים Applied Biosystems, 18S primers לשלוט ריבוזומלי ופלטינה 2x Invitrogen של qPCR supermix UDG עם רוקס וכן נפח מתאים של מים.
3. מערבבים היטב ומניחים 10 μl של כל דגימה לשתי בארות של צלחת או 96 או 384 qPCR היטב.
4. לאחר כל דגימות נטענים, בתוספת בקרה נאותים), לאטום את הצלחת לנתח על מכונת Biosystems יישומית TaqMan 7900HT.
5. תוצאות מבוטאות הביטוי היחסי על מדגם שליטה.

ניתוח פונקציונלי של האנדודרם הכבד נגזר hESC ציטוכרום P450 מבחני - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
1. דגירה 17 יום hESC נגזר HE עם המצע הספציפי 5 שעות 37 ° C (n = 3). השתמש תרבות המדיה כמו רקמההשליטה דגירה שלילית על 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
2. אסוף את supernatants ולבצע את assay לפי הוראות היצרן.
3. מדדו את רמות היחסי של פעילות הבסיס, לנרמל לחלבון מ"ג כפי שנקבע על ידי Assay BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

הערות

הכרכים כולם מבוססים על פורמט 6-גם צלחת. התאם את הכרכים בהתאם לצלחת את הבקבוק או חובה.
כל מדיום, תחול התמיינות והתבגרות מסוננת תחת ואקום לפני השימוש.
בינונית, תחול בידול והתבגרות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. להעריך כמה בינוני נדרשת עבור הניסוי aliquot התקשורת שנותרו בחנות ב -20 ° C לשימוש עתידי.
Matrigel מורכב לפי הוראות היצרן: 1 aliquots מ"ל ניתן לאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
Groגורמים wth עשתה פעם למעלה aliquoted ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר מופשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות.
נוגדן ראשוני משמש בדרך כלל כדי לאפיין HLCs hESC נגזר הוא אלבומין (1:250, Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי).

5. נציג תוצאות:

אפיון hESCs שמרו לפני בידול הכבד

על מנת לאפיין את תא גזע מעמדם של H9 hESCs השתמשו במחקר למדנו מספר פרמטרים. התאים הציג מורפולוגיה hESC, קטן, תאים צפופים גדל במושבות מוגדר (איור 1A) והביע תא גזע pluripotent סמנים גן, אוקטובר, 3 / 4 Nanog (איור 1B). לא מצאנו הבדלים משמעותיים בביטוי של גנים אלה לעומת שליטה קו hESC H7 חיובית. בנוסף, 90.1% מהאוכלוסייה hESCs היתה חיובית עבור הסמן בתאי גזע SSEA-4 (תרשים 1C).

הואSC בידול כדי האנדודרם הכבד

בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות מובחן ביעילות האנדודרם הכבד במבחנה (Hay et al 2008). באותו יום 9 של בידול, התאים נקצרו והבחנה של hESC כדי HLCs הוערך. כפי שדווח בעבר hESCs הציג סדרה של שינויים מורפולוגיים עמוקה, וביום 9, הציג מורפולוגיה hepatocyte מוקדם בפיתוח מראה polygonal (איור 2A). יתר על כן, downregulation של אוקטובר, 3 / 4 על 9 כמובן זמן היום נצפתה (2B איור). לעומת זאת, היו תמלילי הכבד AFP ו אלבומין מעלה מוסדר (איור 2C) מ - 7 יום ואילך.

בשנת התבגרות במבחנה של האנדודרם כבדית

האנדודרם כבדית היה התבגר במבחנה באמצעות ההליך הוקמה (Hay et al 2008). ביום האחרון של תרבויות בידול היו immunostained עבור סמנים הכבד האנושי אלבומין, AFP ו-E-cadherin. התשואה של HLCs באמצעות שלנו ההליך הוא בדרך כלל 90% (Hay et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011). HLCs מוכתם חיובית אלבומין, אלפא fetoprotein ו-E-cadherin (איור 3).

figure-protocol-25468
באיור 1. אפיון hESCs השתמשו במחקר זה. (א) בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות נציג מורפולוגיה hESC שנצפתה תרבות בהגדלה 10x ו 4x. התמונות שנלכדו באמצעות מיקרוסקופ TE3000 / U הפוכה ניקון (ב) hESCs בתרבית הם Octamer (אוקטובר 3 / 4) חיובי חיובי Nanog. H7 hESCs היו להשתמש כביקורת על רמות הביטוי pluripotency גן. הביטוי מתייחס יחסית קפלי אינדוקציה בהשוואה לשלוט גן אנדוגני, β-2-microglobulin. (ג) מגרשים FACS להראות משטח hESC סמן הביטוי רמות, כולל אנטיגנים ספציפיים בשלב העוברי SSEA 4.

69/2969fig2.jpg "/>
באיור 2. (א) בניגוד שלב מיקרוסקופיה נציג תמונות של hESC הנגזרות מורפולוגיה האנדודרם הכבד ביום 9 של בידול שנצפה תרבות, על x4 הגדלה x10. (ב) אפיון השינויים בביטוי הגנים. RNA הופק ואת cDNA נותח על ידי תגובת שרשרת פולימרז כמותי, מראה downregulation פרוגרסיבי של תאים שלא עברו התמיינות ביטוי גנים (אוקטובר 3 / 4) ו - (ג) upregulation של ביטוי גנים hepatocyte (אלבומין ו α-fetoprotein). הביטוי מתייחס יחסית קפלי אינדוקציה בהשוואה לשלוט גן אנדוגני, β-2-microglobulin ביום 0 של בידול. P <0.05 מצוין * ו P <0.001 מצוין *** נמדד על ידי סטודנטים מבחן t בהשוואה hESCs ביום 0. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן 1.

figure-protocol-26873
באיור 3. Characterisation של האנדודרם-hESC נגזר הכבד
Immunocytochemistry מראה ביטוי של סמנים hepatocyte, אלבומין, AFP ו-E-cadherin ב hESC (H9) האנדודרם הכבד נגזר. בקרות שליליות בוצעו עם אימונוגלובולינים G המקביל (IgG) ונציגי התמונות מוצגות.

figure-protocol-27275
איור 4. (H9) hESC HLCs נגזר בתערוכה הפעילות המטבולית. בגיל 17 יום, H9 הבדיל כדי HLCs הציג פעילות CYP3A מטבולית (n = 6).

Discussion

פיתחנו מודל פשוט, הומוגנית לשעתקו מאוד במבחנה כדי לייצר רמות להרחבה של HLCs האדם. המודל שלנו קיבל תוקף על ידי מספר מעבדות פעולה חיצוניים. אנו שגרתי לאפיין בתאי גזע שמקורם HLCs באמצעות ארגז הכלים שלנו לבית של סמנים התפתחותי מסוים מבחני תפקודי כבד (שרובם זמינים מסחרית)...

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

ד"ר חי נתמכה על ידי מלגה RCUK, ד"ר המערבית נתמכה על ידי מחלקת כירורגיה, ד"ר Medine נתמך על ידי מענק מהקרן Core BHF, מר בלטסאר Lucendo-Villarin נתמכה על ידי דוקטור MRC Studenship. ד"ר ג'ואו נתמכה על ידי מלגה מהממשלה הסינית.

Materials

Matrigel לוחות ציפוי צלוחיות

Matrigel (10 מ"ל, BD Biosciences, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
KO-DMEM (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
תרבות רקמות צלחות (6 טוב, 12 טוב, קורנינג, בריטניה)
תרבות רקמות צפחת (25 CM2 פרקו, קורנינג, בריטניה)

hESC תחזוקה

עכבר בינוני פיברובלסטים עובריים מותנה (MEF-CM) (100 מ"ל, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
פתרון BSA (50 מ"ל, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
צמיחה האדם הבסיסיות גורם פיברובלסטים (100 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.

HESCs Passaging עם collagenase

גם בקבוק ומחוברות או hESCs.
Matrigel בארות מצופה צלוחיות או על פי הצורך.
Phospate שנאגרו מלוחים (-MgCl _{2,-CaCl 2)} (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); לאחסן בטמפרטורת החדר.
Collagenase IV (1 גרם, Gibco, Invitrעוגן, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
עכבר בינוני פיברובלסטים עובריים מותנה (MEF-CM) (100 מ"ל, R & D מערכות, ארה"ב).
צמיחה האדם הבסיסיות גורם פיברובלסטים (100 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב).

דיפרנציאציה של hESCs האנדודרם אל הכבד

RPMI 1640 (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
B27 מוסף (10 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
Activin (2 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
רקומביננטי עכבר Wnt3a (2 מיקרוגרם, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
KO-DMEM (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
KO-SR (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
ללא חומצות אמינו חיוניות (100 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
β-Mercaptoethanol (10 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב 4 ° C.
DMSO (סיגמא אולדריץ', בריטניה); לאחסן בטמפרטורת החדר
ליבוביץ L-15 תרבות בינוני (500 מ"ל, Sigmאולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
Tryptose פוספט מרק (100 מ"ל, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב 4 ° C.
Foetal שור בסרום, חום מומת (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
21-hemisuccinate (100 מ"ג, סיגמא אולדריץ', בריטניה) הידרוקורטיזון: חנות ב -20 ° C.
אינסולין (הלבלב שור) (100 מ"ג, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב -20 ° C.
L-גלוטמין (100 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); חנות ב -20 ° C.
חומצה אסקורבית (25 גרם, סיגמא אולדריץ', בריטניה); חנות ב -20 ° C.
האדם HGF (10 מיקרוגרם, Peprotech, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
רקומביננטי Oncostatin M האדם (OSM) (50 מיקרוגרם, R & D מערכות, ארה"ב); חנות ב -20 ° C.
מזרק מונעת יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר (Millipore, בריטניה)

אפיון האנדודרם נגזר hESC כבדית

Immunostaining

פוספט חיץ מלוחים (-MgCl _{2,-CaCl 2)} (500 מ"ל, Gibco, Invitrogen, בריטניה); stoמחדש בטמפרטורת החדר.
PBST, PBS מורכב עם 0.1% tween 20 (Sigma-Aldrich, בריטניה).
Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, בריטניה) מורכבת ב-PBS, חנות -20 ° C.
גליצרול (Sigma-Aldrich, בריטניה), לאחסן בטמפרטורת החדר.
טריס Base (Sigma-Aldrich, בריטניה), לאחסן בטמפרטורת החדר.
אתנול
סרום (עבד Serotech, בריטניה), לאחסן ב -20 ° C.
נוגדן משניים, fluorophores אלקסה (בדיקות מולקולריות, Invitrogen, בריטניה).
MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, ארה"ב) מורכב ב טריס HCL וגליצרול כמו לכל הוראות היצרנים. DAPI (פירס, תרמו פישר סיינטיפיק, בריטניה) הוא הוסיף הפתרון MOWIOL בדילול 1:1000.

Name	Company	Catalog Number	Comments
ראשי נוגדנים
Antigen *	סוג	ספק	מהילה
Alb	חד שבטיים עכבר	סיגמא אולדריץ'	1 / 5 00
E-cadherin	חד שבטיים עכבר	Millipore	1 / 100
α-fetoprotein	חד שבטיים עכבר	סיגמא	1 / 500
SSEA-4 FITC	חד שבטיים עכבר	Biolegend	1 / 100
IgG	חד שבטיים עכבר	DAKO	1 / 500
משני נוגדנים
אנטי עכבר FITC המצומד	חד שבטיים עיזים	Invitrogen	1 / 400

טבלה 2. הנוגדנים המשמשים hESC נגזר immunostaining הכבד האנדודרם, בריכוזים השתמשו, המינים התפתחו וחברות שהם שנרכשו.

ניתוח פונקציונלי של האנדודרם הכבד Normalisation (לכל חלבון מ"ג)

ss = "jove_step"> מבחני ציטוכרום P450

P4-Glo CYP3A4, CYP1A2, ערכות ו luminometer (Promega, ארה"ב).
לבן קרקעית שטוחה 96 גם assay צלחת (BD Biosciences, בריטניה).
BCA Assay Kit (פירס, תרמו פישר סיינטיפיק, בריטניה).
Assay שקוף 96 צלחת גם (Iwaki, בריטניה)

References

Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).
Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism. Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).
Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice. Liver International. 31, 254-262 (2011).
Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening. Toxicology. 278, 250-255 (2010).
Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery. Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).
Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation. Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).
Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).
Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).
Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment. Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

56 hESC hepatocyte

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: