Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Summary

Assay הקמת הצינור משמש להערכת פעילות כלי הדם של תאים סרטניים.

Abstract

במהלך העשורים האחרונים, assay היווצרות צינור באמצעות גורם הגדילה מופחת Matrigel כבר מועסקים בדרך כלל כדי להדגים את פעילות angiogenic לתאי אנדותל של כלי דם במבחנה ^1-5. עם זאת, הראיות לאחרונה גדל הראה כי זה assay אינו מוגבל לבחון את התנהגותו של כלי הדם ותאי האנדותל. במקום זאת, הוא גם נעשה שימוש כדי לבחון את היכולת של מספר תאים סרטניים לפתח פנוטיפ וסקולרית ^6-8. יכולת זו עולה בקנה אחד עם התנהגות vasculogenic שלהם מזוהה בחיות xenotransplanted, תהליך המכונה vasculogenic חיקוי (VM) ^9. יש שפע של ראיות להוכיח כי VM גידול התא בתיווך ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות הגידול, עצמאית של אנגיוגנזה תא האנדותל ^{6, 10-13.} לדוגמה, תאים סרטניים נמצאו להשתתף היווצרות perfused דם, כלי דם בתוך ערוץ דגימות רקמה של חולים מלנומה גליובלסטומה ^{8, 10, 11.} כאן, אנו תיאר assay רשת צינורי ככלי שימושי להערכת הפעילות vasculogenic של תאים סרטניים. מצאנו כי כמה שורות תאים סרטניים כגון מלנומה B16F1 תאים, גליובלסטומה U87 תאים סרטן השד מד"א-MB-435 תאים מסוגלים טופס tubules כלי הדם, אך יש כאלה שלא כמו סרטן המעי הגס HCT116 תאים. יתר על כן, זה פנוטיפ כלי הדם תלויה מספרים התא מצופה על Matrigel. לכן, assay זה עשוי לשמש כלי רב עוצמה למסך את הפוטנציאל של כלי הדם של מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאים של כלי הדם, תאים סרטניים, כמו גם תאים אחרים.

Protocol

1. Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

1. הכנת תאים סרטניים לתאי אנדותל כלי הדם: גידול במוח תאים כגון U87 תאים, התאים B16F1 מלנומה, סרטן השד MDA-MB-435, ותאי המעי הגס HCT116 גדלו DMEM בתוספת 10% FBS ו פניצילין / סטרפטומיצין (כולם Invitrogen ). האנדותל קו התא בתאי אדם אנדותל כלי הדם (HMVECs) היו בתרבית בינוני EBM2 (Lonza) בתוספת הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 1 ng / ml גורם הגדילה באפידרמיס, 10% FBS ו פניצילין / סטרפטומיצין. תאים נשטפו עם PBS שלוש פעמים מנותקת עם 0.05% טריפסין / EDTA (Invitrogen). לאחר צנטריפוגה עם 2,000 סל"ד 5 דקות, כדורי תא נשטפו שוב עם PBS. לאחר מכן, התאים pelleted נמנו עם hemocytometer.
2. הכנה Matrigel: aliquot של גורם הגדילה מופחת Matrigel (BD Bioscience) היה מחומם בטמפרטורת החדר. לפני מופשר לחלוטין, הועבר על גבי קרח נוזלי שלה הוחזק על קרח דק 'לפחות 10. ואז 50 μl של Matrigel היה מצופה כדי 96-היטב צלחות ברמה אופקי המאפשר Matrigel להפיץ באופן שווה מודגרות למשך 30 דקות ב 37 ° C.
3. היווצרות Tube: תאים (1-2 x 10 ⁴⁾ מחדש מושעה עם סרום ללא DMEM של תאים סרטניים או EBM-2 עבור בתאי האנדותל, והעמיסו על החלק העליון של Matrigel. אם זה assay שימש למדידת ההשפעות של כמה סוכנים על פיתוח אבובית, סוכנים אלה (לגירוי או מעכבי) נוספו בינוני סרום ללא. כל קבוצה מותנית הכלול 4-6 בארות.
4. תמונה וניתוח נתונים: לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כל אחד גם נותח ישירות תחת מיקרוסקופ. אם tubules נדרשו עבור קיבעון, 100 μl של פתרון 10% מלוחים מבוססי פורמלין נוספה בעדינות ועשר דקות מאוחר יותר, הוא היה מוכן לניתוח. תחת מיקרוסקופ עם ניגודיות שלב 10x, tubules בכל תחום היו הדמיה ו בממוצע tubules 3-5 שדות אקראי היטב כל נמנה.

2. נציג תוצאות:

HMVECs שימשו כביקורת חיובית, כמו אלה שפותחו tubules ברור גופי התא מוארך המתחברים בצורה רשת מצולע. תאים B16F1, U87, ואת מד"א-MB-435 שפותחה tubules כלי הדם דומה לזו שהוקמה על ידי HMVECs, אבל HCT116 תאים לא (איור 1). היווצרות תא מינון תלויי הצינור נבדק U87 תאים. כפי שמודגם באיור 2, 10,000 תאים נוצרו tubules הופסק. לאחר התאים הוכפלו, רשת כלי הדם היה מוצק דומים לאלה לראות HMVECs. לעומת זאת, התאים פחות מ 5000 לא הצליחו ליצור פנוטיפ וסקולרית.

באיור 1. היווצרות Tube המושרה על ידי HMVECs, U87, מד"א-MB-435, ו B16F1 תאים, אך לא HCT116 תאים. כל התאים (2 x 10 ⁴⁾ הועמסו על Matrigel ו מודגרות לילה. Tubules היו צילמו באמצעות הניגוד שלב. HMVECs שימשו כביקורת חיובית. נציג של 3-5 שדות הוצגה. בר: 100 מיקרומטר.

2. איור U87 תא-Induced tubules במספר תלויי תא אופן. מספרים שונים של תאים U87 כפי בפינות שימשו להקמת הצינור. HMVECs שימשו בקרה חיובית. בר: 100 מ"מ.

Discussion

על מנת assay הזה להצליח, איכות Matrigel יש לבדוק תחילה. מדגם קטן ניתן לקבל BD Bioscience מראש בטווח assay באמצעות HMVECs. מוצרים אצווה שונים עשויים להציג איכויות שונה שבו הרבה מסוימים אינם מספקים מצב אופטימלי להקמת הצינור. שנית, כל הבועות יש להימנע כאשר aliquot של Matrigel נטען צלחות 96 ובכן, מפנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
גורם צמיחה מופחת Matrigel	Bioscience BD	47743-720
EBM2 ערכת	Lonza	CC-3156
Nikon Eclipse מיקרוסקופ TS100	ניקון