פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

Summary

נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.

Abstract

במערכת העצבים המרכזית, יונקים, סוגים שונים של נוירונים עם מאפיינים מולקולרית ופונקציונלית מגוונים הם התערבבו זה עם זה, קשה להפריד וגם לא מזוהה בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם. לכן, לעיתים קרובות קשה לנתח ביטוי גנים בסוג נוירון ספציפי. כאן אנחנו המסמך הליך המשלב כל תא מהדק תיקון טכניקות הקלטה עם תא בודד polymerase תגובת שרשרת הפוכה שעתוק (scRT-PCR) ביטוי mRNA פרופיל סוגים שונים של נוירונים nigra משמעותי. טכניקות אלקטרו משמשים הראשון להקליט את המאפיינים neurophysiological ופונקציונלי של נוירונים בודדים. ואז, הציטופלסמה של נוירונים בודדים nigral מאופיין electrophysiologically הוא aspirated ו נתון ניתוח scRT-PCR לקבל ביטוי פרופילים mRNA לסינתזת אנזימים הנוירוטרנסמיטר, קולטנים, ואת תעלות יונים. הסלקטיביות רגישות גבוהה ולעשות שיטה זו שימושית במיוחד כאשר אימונוהיסטוכימיה לא ניתן להשתמש בשל חוסר של נוגדנים מתאימים או רמת ביטוי נמוכה של החלבון. שיטה זו היא גם החלים על הנוירונים באזורים אחרים במוח.

Protocol

1. פרוסת המוח הכנה

1. צעירים (15-40 ימים) זכר ונקבה Sprague-Dawley חולדות משמשות. (בנוסף, אנו משתמשים בפרוטוקול זה זהה אצל עכברים.) תחת הרדמה urethane עמוק, בעלי חיים ערופה לבין המוח הוא גזור במהירות החוצה. אז 300 מיקרומטר בעובי פרוסות המוח העטרה המכיל את חלק substantia nigra midrostral של נחתכים על vibratome לייקה (VT-1200S). פרוסת חיתוך ההליך מתבצע סוכרוז, קר כקרח גבוה מחומצן חיתוך תמיסה המכילה (מ"מ): 220 סוכרוז, 2.5 KCl, 1.25 לאא ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0.5 CaCl _2, 7 MgCl _2, D-10 גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO ₂ / 5% ₂ כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. שמור את הפתרון חיתוך קר כקרח במהלך ההליך.
2. פרוסות המוח מודגרת בתא דגירה מלאים בנוזל השדרתי חמצן מלאכותי (aCSF) המכיל (מ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2.5 CaCl _2, 1.3 MgCl _2, 10 D-גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO ₂ / 5% ₂ כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. טמפרטורת הדגירה היא 34 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר עד פרוסה במוח מועבר לתא הקלטה.

2. טביעת אצבע של נוירונים אלקטרו nigral

1. פרוסה אחת במוח מועבר תא מהדק הקלטה תיקון perfused ברציפות ב 32 עם aCSF מחומצן ° C.
2. Pipettes תיקון המגיעים autoclaved בורוסיליקט (KG-33) צינור זכוכית נימי (id 1.10 מ"מ, 1.65 מ"מ od, המלך Precision זכוכית, קלרמונט, CA) באמצעות חולץ PC-10 (Narishige, טוקיו, יפן) ומלא פתרון תאיים מוכן עם מים DNase-RNase חינם (פישר סיינטיפיק) (המכיל 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, HEPES 10 מ"מ, 1.5 מ"מ MgCl _2, ה-pH המותאמת 7.3). Pipettes תיקון יש התנגדויות של 2-3 MΩ באמבטיה.
3. Substantia nigra מזוהה לפי המיקום האנטומי הייחודי (איור 1A1-2). תחת הדרכתו החזותי של מיקרוסקופ וידאו (אולימפוס BX51W1) מצויד Nomarski אופטיקה טבילה במים 60x עדשה, תאים גדולים nigra substantia Pars compacta (SNC) ו substantia nigra Pars reticulata (SNR) (אפשרי נוירונים התובע לבין נוירונים GABA) נבחרים הקלטה. קונבנציונלי גיגה אוהם תצורה הדוק כל תא חותם מתקבל (איור 1B1). נוכחי מהדק מתח מנתח מהדק יכול להתבצע. כדי למזער השפלה mRNA, הקלטה אלקטרו צריך להיות קצר (≤ 5 דקות). אפשרות אחת היא להקליט רק את הממברנה ותכונות spiking לתת טביעות אצבעות אלקטרו עבור הנוירונים של אינטרסים (איור B2-3). זו הקלטה קצרה לוקח רק על 1 דקות.

3. הציטופלסמה שאיפה

1. אחרי אפיון אלקטרו טביעת אצבע של SNR GABA ונוירונים התובע, יניקה בפה עדין מוחל לשאוב את הציטופלסמה. גרעין התא יכול להיות גם aspirated, וכתוצאה מכך זיהום הדנ"א הגנומי. החותם הדוק לא צריך להיות שבור, פסולת תאית אחרת, כולל ה-mRNA יכול להיות נשאב לתוך פיפטה את התיקון ולזהם את תוכן התא. היושרה של החותם הדוק הוא טוב כל עוד הגידול הנוכחי מחזיק ב -70 mV אינו עולה על 100 הרשות.
2. אז תוכן התא aspirated הוא גורש לתוך צינור 0.2 PCR מ"ל ידי שבירת קצה פיפטה ו לחץ חיובי קטן. תוכן אחת של התא נאספים לתוך צינור PCR אחת. לאחר שקיבל את תוכן התא, צינור איסוף PCR, טרום מקורר על הקרח, ממוקם מיד במקפיא C -20 °.
3. כדי לשלול זיהום של פסולת תאית שעשויות להכיל mRNAs, פיפטה את התיקון הוא הוריד לתוך הרקמה מבלי aspirating בציטופלסמה ולאחר מכן את תוכן פיפטה נתונה RT-PCR.

4. שעתוק הפוך (RT)

1. לאחר איסוף תוכן התא ממספר סביר של נוירונים, בדרך כלל 10-20, RT צריך להתחיל מיד כדי למזער את ההשפלה של mRNAs.
2. מאז כמות התוכן הסלולרי של נוירון יחיד הוא קטן מדי, נוהל בידוד RNA לא מבוצע. כדי להסיר את ה-DNA הגנומי פוטנציאל זיהום, תוכן התא aspirated מתעכל לראשונה על ידי DNase אני (5 μL DNase I ו 1.6 μL DNase אני הצפת, 5 דקות במהירות של 25 ° C). ואז אני DNase הוא מובטל ידי הוספת 1.2 μL 25 mM EDTA ו דוגרים על 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. cDNA הוא מסונתז באמצעות III עילי הפוך transcriptase מבוססי תאים, ישיר ערכת סינתזה cDNA (Invitrogen, טבלה 1). גדיל ראשון cDNA הוא מסונתז על 50 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, אז התגובה היא מומת על ידי הדגרה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו 1 μL RNase H היא להוסיףעורך לעכל mRNA (37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). חד גדילי cDNA מאוחסן ב -20 מעלות הגברה PCR מאוחר יותר.
4. הסרה מלאה של הדנ"א הגנומי מאומת על ידי שליטה RT-מינוס שבו transcriptase הפוכה מושמט כאשר כל מרכיבי התגובה האחרים היו בדיוק אותו הדבר.

5. שני ה-PCR הגברה הבמה

1. Primers תוכננו על פי רצפים GenBank. במידת האפשר, אינטרון, פורש זוגות פריימר שימשו המסייעים לזהות זיהום הדנ"א הגנומי. זוג רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2. היעילות של זוגות פריימר צריך להיות מאומת ראשון של mRNAs המוח כולו, כי התשואה מוצרים חיובית. Primers כל מסונתזים על ידי DNA משולב טכנולוגיות (Coralville, איווה, ארה"ב).
2. בשלב הראשון, 5 μL של 30 cDNAs μL מוגבר במשך 35 מחזורים בנוכחות זוג פריימר (טבלה 2). פרוטוקול רכיבה תרמית של Cycler תרמית (MasterCycler, Eppendorf, טבלה 1) הוא 2 דקות ב 94 מעלות denaturation הראשונית, ואז 35 מחזורים של 15 שניות על 94 ° C עד לפגל, 30 זה ב 55 ° C כדי לחשל, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס להרחיב, ואחריו 7 דקות הארכה סופית. תקי פולימראז ה-DNA, triphosphates deoxynucleotide (dNTPs), ואת כל המרכיבים האחרים הדרושים הגברה PCR מסופקים על ידי סופר PCR לערבב (Invitrogen, טבלה 1)
3. במהלך שלב ה-PCR השני, המוצר של μL 1 מתוך הגברה שלב 1 ^st PCR משמש כתבנית וזוג תחל אותה משמש בשלב הראשון משמש (טבלה 2). 40 מחזורים הם זמן לרוץ עם סיומת מקוצר עד 30 s. לערבב אותו PCR סופר משמש.
4. מוצרי ה-PCR מן הגברה 2 ^nd הבמה מופרדים באמצעות אלקטרופורזה agarose 2.5% ג'ל, דמיינו ידי ethidium ברומיד (0.05 mg/100 מ"ל ג'ל) או gelgreen תחת אור UV, וצילם (איור B4). להקות חיוביות ואז לגזור, חילוץ באמצעות ערכת חילוץ Qiagen (טבלה 1) ואת רצף, והשוו עם רצפים לאור של גני מטרה.

6. נציג התוצאות:

(DA) דופאמין נוירונים nigra substantia Pars compacta ו Pars reticulata ועל נוירונים שכנים הקרנת GABA ב nigra substantia Pars reticulata יש מאפיינים אלקטרו ברורים (Zhou et al 2006;. דינג et al 2011).. כפי שמוצג באיור. 1B2, SNR נוירונים GABA התערוכה spiking בתדירות גבוהה ספונטני סביב 10 הרץ. קוצים יש בסיס משך סביב 1 ms. עם hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, SNR נוירונים GABA להציג לשקוע depolarizing חלש בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חלש של אני _ח הנוכחי הנוירונים האלה (איור 1B2). לעומת זאת, הנוירונים nigral התובע התערוכה תדר נמוך (סביב הרץ 2) קוצים ספונטנית, כי יש בסיס משך סביב 3 ms. נוירונים התובע גם להציג לשקוע מבוטא בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חזק של אני _ח הנוכחי (איור 1B3) (Zhou et al 2006;.. דינג et al 2011).

scRT-PCR לאתר mRNA עבור decarboxylase חומצה גלוטמית 1 (GAD1, האנזים מפתח לסינתזה גאבא ו סמן נוירונים GABA) ב מזוהה electrophysiologically SNR נוירונים GABA, אך לא התובע נוירונים (איור 1B4, 5). לעומת זאת, מזוהה scRT-PCR mRNA עבור hydroxylase טירוזין (TH אנזים המפתח לסינתזת הדופמין סמן נוירונים DA) ב SNC מזוהה electrophysiologically ו SNR נוירונים התובע, אך לא נוירונים GABA (איור 1B4, 5). אז scRT-PCR התוצאות לאשר את הזיהוי נוירון אלקטרו. בשלב הבא, scRT-PCR שימש פרופיל ביטוי של מתח המופעל Kv3 יחידות משנה הערוץ, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4. יחידות משנה אלה תורמים ליצירת מתח מגודרת-K ⁺ ערוצי מאפיינים שונים תלוי בהרכב למקטע (דינג et al. 2011). בדוגמה SNR GABA נוירון באיור. 1B4, mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. בדוגמה SNR התובע נוירון שמוצג Fig.1B5, רק Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. ב נתונים ונקווה שלנו, Kv3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר נוירונים GABA SNR מאשר נוירונים nigral התובע, המעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של Kv3.1 ב מהיר spiking SNR GABA נוירונים (דינג et al. 2011).

באיור 1. זיהוי אלקטרו SNR של GABA נוירונים nigral נוירונים התובע:.. אזורים nigral ניתן לזהות על פי המיקום האנטומי שלהם ברורים A1 מציג את המיקום של SNC ו SNR בקטע Nissl מוכתם העטרה שנתפסו עם מטרה 1X. אזור התאגרף היה capturעורך עם מטרה 10X ומוצגים באמצע כפי שמציין החץ. SNC תאים עשירים לעניים SNR תאים גלויים לעין. A2 מציג את המיקום של SNC ו SNR במקטע, לחיות העטרה בלא כתם שנתפסו עם מטרה 4X. SNC תא עשיר התא עניים SNR גם לזיהוי בבירור. VTA, אזור tegmental הגחון. B1 מראה GABA SNR תיקון נוירון להיות מהודקת במצב כל תא. B2 מציג את המאפיינים אלקטרו הטיפוסי של נוירונים GABA SNR במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. אלו נוירונים ספונטנית אש פעולה בתדירות גבוהה הפוטנציאל של זמן קצר ויש לי חלש אני _ח בתיווך התגובה לשקוע אל hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. B3 מציגה מאפיינים אלקטרו אופייני nigral נוירונים התובע במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. הם אש נמוכה פעולה ספונטנית תדירות הפוטנציאלים של משך הזמן הארוך יש בולט אני _ח בתיווך סאג (ראש החץ) בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. לפיכך, SNR נוירונים GABA ונוירונים דופמין nigral מזוהים בבירור electrophysiologically. B4 מראה תמונה של ג'ל scRT-PCR מוצרים אלקטרו מזוהה SNR GABA נוירון. Decarboxylase גלוטמט 1 (GAD1) ​​mRNA אך לא hydroxylase טירוזין (TH) mRNA זוהה. mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה GABA SNR נוירון. B5 מראה scRT-PCR לזיהוי של נוירונים mRNAs Kv3 ערוץ התובע SNR נוירון. TH-mRNA אך לא mRNA GAD1 זוהה זוהו electrophysiologically SNR התובע נוירון. mRNAs עבור Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה התובע SNR נוירון. B6 מציג נתונים ונקווה.

7. פוטנציאל חיובי כוזב תוצאות שליליות שווא

בהתבסס על הניסיון שלנו, מספר גורמים יכולים להוביל שווא scRT-PCR תוצאות שליליות. גורמים אלה כוללים כישלון aspirating כמות מספקת של הציטופלסמה בשל תיקון סתימת פיפטה קצה, זיהום RNase, ולא יעיל primers PCR. תיקון סתימת פיפטה קצה בדרך כלל ניתן לראות על צג וידאו והצביע על ידי התנגדות גישה מוגברת. זיהום RNase יכול להימנע על ידי שחרור משרות יסודית כפפות. יעילות ה-PCR פריימר צריך להיבדק באמצעות RNA סך של רקמת המוח אגרוף (Zhou et al 2008;.. דינג et al 2011).

מאז אנחנו תמיד להשתמש DNase קודם לטפל בדגימות שלנו לפני RT, אנחנו לא נתקלים תוצאות חיוביות כוזבות. באופן תיאורטי, ללא DNase העיכול, זיהום הדנ"א הגנומי ובכך זיהוי חיובי כוזב עשוי להתרחש כאשר הגן הוא intronless או זוג פריימר אינו תוחלת האזור אינטרון.

Discussion

השילוב של הקלטה תיקון מהדק ב פרוסה המוח עם scRT-PCR הראינו כאן לספק שיטה מצוינת לחקור את ביטוי ה-mRNA פרופילים עבור תעלות יונים, קולטנים, ואנזימים מפתח לסינתזה הנוירוטרנסמיטר בנוירונים מאופיין בנפרד. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר החלבון המדובר לא ניתן לאתר מקומי בשיטות אחר...

Materials